mRNAの製造
メッセンジャーRNA（mRNA）は急成長しているバイオ医薬品のひとつです。期待値が大きい一方で、この分野はまだ発展段階にあります。新型コロナウイルス感染症に対するmRNAワクチンの迅速な開発で実証されたように、mRNA治療薬は、難病に対する標的治療やフレキシブルな製造に新たな機会を提供します。mRNAの臨床上の可能性はワクチンにとどまらず、タンパク質補充療法、遺伝子治療、がん免疫療法など、その他の高度治療にも及びます。ザルトリウスでは、業界を牽引する精製技術から、mRNA製造への取り組みが始まりました。当社の包括的な知識は今や、mRNA原薬製造プロセス全体へと拡大しています。
mRNAはDNAから転写される一本鎖の核酸であり、遺伝子発現の重要な構成要素の代表となっています。その臨床機能を発揮するために、mRNA分子は標的組織に運ばれ、コードされたタンパク質が細胞内で生産されるよう誘導します。治療用mRNAは内因性mRNAの作用を模倣することで、治療用遺伝子組換えタンパク質がもつ免疫原性や製造面での課題を回避します。mRNAの発現も一時的で、mRNA分子の安定性は遺伝子発現と直接関係します。したがってmRNAが細胞内に留まる時間が長いほど、コードされているタンパク質は多く産生されます。
mRNA製造に伴う課題とザルトリウスの精製ツールボックスをご覧ください。
mRNA製造プロセス
対象遺伝子からmRNAまで
初めに、対象遺伝子をコードするDNA配列をプラスミドに挿入します。このplasmid DNA (pDNA)を、宿主細菌（一般的に大腸菌が用いられます）を用いて増幅させてから精製して直鎖にします。mRNAはpDNAテンプレートから合成されます。pDNAテンプレートは酵素とヌクレオチドと共にインキュベートされ、mRNAを作成します。この手法はin vitro転写（IVT）法と呼ばれ、細胞を使用しないプロセスとなります。
新たに作成されたmRNA分子はそのあと、酵素、残存ヌクレオチド、核酸などの不純物を除去することで、分離されます。最後にmRNAを濃縮してろ過滅菌し、LNPにカプセル化する準備が整います。
IVTプロセスは標準化されていないため、mRNA精製プラットフォームの開発は制限されています。画一的なプロセスもありません。例えば、キャプチャーする方法の選択はmRNAコンストラクトに応じて異なります。
- mRNAは、せん断応力と酵素分解に弱い不安定な高分子です。
- mRNAは、二本鎖RNA（dsRNA）、切断型mRNA、DNA等の類似特性をもつ夾雑物から分離する必要があります。
- 不十分な分析ツールが製造プロセスの最適化を阻んでいます。
mRNA合成 │ In Vitro転写とキャッピング
mRNA分子は通常、in vitro転写（IVT）反応により直鎖pDNAから合成されます。IVT反応にはDNAテンプレート、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、キャッピング酵素が必要です。様々なmRNAコンストラクトの合成にはそれぞれ固有の条件が必要で、推奨手順に合致しないこともあります。同様に、生産性を最適化するために、精製工程を断続的に行うこともあります。
- 試薬の消費とmRNA生産速度を監視する、CIMac PrimaS™に基づく迅速なHPLC分析
- IVT反応は、製造スケールまで閉鎖系バイオリアクターシステム内で行うことができます。
- 当社のBiostat STR®は、抽出物と溶出物を最小限に抑えるための独自の堅牢なフィルムを備えた、実績のあるバイオリアクターです。自動化技術により、IVTに使用する幅広いプロセス分析技術の統合が加速されています。
- Flexsafe® Pro Mixer技術は、pH、伝導率、温度のセンサーを搭載した、唯一のシングルユースミキシングソリューションです。完全閉鎖系デザインで低せん断力と高速ミキシングの両方に対応するこのミキサーは、mRNAのような壊れやすい分子の低せん断性ミキシングに最適です。
mRNAのキャプチャー
mRNAをキャプチャーしながら、mRNAを精製し、IVT試薬（ヌクレオチド、pDNA、酵素を含む）を除去します。mRNAのキャプチャーは通常、親和性の相互作用やmRNA分子の化学的特性に基づくクロマトグラフィーによって行います。 しかし、mRNAは、サイズの大きさ、夾雑物との類似性、不安定性などの性質があり、その分離の成功が妨げられることがあります。さらに、スケーラブルな精製技術の採用が遅れれば、大規模なものでさえ実験室規模の精製法に頼らざるを得なくなります。モノリス型カラムは、結合・溶出モードでの高流量と高い不純物除去率を提供し、効率的なmRNAのキャプチャーを促します。
化学組成が類似しているものを含め、不純物から、高分離能でmRNAを分離することができる、効率的かつスケーラブルな精製テクノロジー。
- 生産性を向上させる高い能力
- 高速処理を行うプラグアンドプレイシステム
- あらゆる製造プロセスに適用できるフレキシブルなソリューション
- 高いmRNA分子回収率
Allegro single-useクロマトグラフィーシステムは、パイロット生産、臨床試験製品の生産、商業生産用に設計されています。 フレキシブルなモジュラーデザインにより、モノリス型カラムのオペレーションをアイソクラティック、またはグラジエントの設定で行うことができます。
mRNAのポリッシング
ｍmRNAキャプチャー後に残っている不純物（タンパク質、dsRNA、切断型RNAを含む）に対してポリッシングを行うことがあります。mRNA治療薬のような絶えず進歩する分野では、あらゆる種類の混入物を除去し、目的の分子が臨床用として必要な品質要件を確実に満たすための、包括的なツールが必要です。
Allegroシングルユースクロマトグラフィーシステムは、パイロット生産、臨床試験製品の生産、商業生産用に設計されています。フレキシブルなモジュラーデザインにより、モノリス型カラムのオペレーションをアイソクラティック、またはグラジエントの設定で行うことができます。
濃縮、バッファー交換・透析、ろ過滅菌
濃縮とバッファー交換・透析のステップでサンプルの容量を減らし、バッファー中の低分子を除去します。この処理はプロセス全体を通して各段階で行うことができます。精製後のmRNAを最終ステップでろ過滅菌します。
mRNAの、分解とせん断応力への弱さに対応した穏やかなろ過法。
- mRNAの不安定性にかかわらない、最大の回収率
- RNaseなどの新たな夾雑物が最終製品に混入するリスクを抑える
ザルトリウスは、ガンマ線照射対応カセットなどの機能を備えた、mRNAの濃縮とバッファー交換・透析のための直観的でユーザーフレンドリーな精製ソリューションを提供しています。Hydrosart®はmRNAの吸着性を抑えるよう設計された最先端のクロマトグラフィーメンブレンであり、あらゆるアプリケーションとの適合性が確保されています。
- 分子量カットオフ値2 kD～300 kDのメンブレンを利用可能
- 低吸着性、高流量、生成物回収率の増加を実現
- 化学物質、蒸気、熱、ガンマ線照射に抵抗性をもち、濃度40%以下のエタノールとともに使用可能で、低ファウリングで幅広い操作条件に対応
- ガンマ線滅菌が可能なSartocon® Self Contained Units（0.1m²～14m²）は、閉鎖系でスケーラブル、すぐに使えるプロセス
- Sartopore®は最も幅広いPES膜の組み合わせ of PESを実現します。最低限のろ過コストで、あらゆる種類の生成物に完璧に対応します。 0.2 µmと0.45 µmの孔径をご用意しています。これらのメンブレンにより、高い保持率のろ過滅菌が可能になります。デザインや仕様を事前に設計できるトランスファーセットは、ガンマ線照射済みです。
- クロスフローシステムの幅広いラインアップ は、、大規模な商業生産までのプロセス開発のニーズまでカバーしています。シングルユースでガンマ線照射済みの流路を備えた、機能的に閉鎖系のソリューションを実装するオプションもあります。
原薬の保管と輸送
バイオ医薬品は貴重であるだけでなく、多くの場合、生産、保管、他の施設への輸送の間、慎重な取扱いを必要とするセンシティブな製品です。原薬の保管と輸送方法を詳細に計画しておくことは、製品の品質を保ち、患者の安全性を確保するために不可欠です。 mRNA治療薬をはじめとする多くの製剤は凍結保存をすることで、化学的・生物学的な劣化を遅らせ、製剤の有効期限を伸ばし、微生物の発育を制限し、せん断応力による過剰な振とうを防ぎます。
センシティブなmRNA分子を保護する凍結保存と輸送のためのソリューション
- 環境変動を制限し製剤を保護するための、堅牢で信頼性のあるソリューション
- mRNAの全プロセスを追跡できる、安全、確実、トレーサブルなシステム
- 凍結濃縮による影響は限定的
当社Celsius®製品ラインアップでは、安全で簡素化したt凍結バイオ医薬品製品製剤の輸送と保存を確実に行うための、シングルユースでガンマ線照射済み、すぐに使える製品を取り揃えています。
凍結｜融解プラットフォームを完備したCelsius® CFT
- 堅牢性、スケーラビリティ、再現性を備え、追跡記録に定評のある、使いやすい縦型温度制御式プレートフリーザー
- 大規模な凍結｜融解プロセスで認められる凍結濃縮による影響を軽減する、振とう機能付きの制御機能と急速凍結｜融解機能
- 高い処理容量（最大100 L）
Celsius® S3 ベンチトップシステム－商業生産まで対応可能 。
- フリーズパス長と熱交換技術が大規模生産設備と同じであるため、凍結｜融解プロトコルの移行が可能
Celsius® FFTp－既存の設備を利用する、組み立て済みですぐに充填できるシングルユース容器 。
- 当社の革新的SafecoreTM技術により高い堅牢性を確保したCelsius® FFT/FFTp容器は、ワーストケース条件での輸送に対して最低-80°Cまで十分に対応可能
- Celsius® FFTはあらゆる従来型のフリーザーで使用可能、Celsius® FFTpはプレートフリーザー専用設計
脂質ナノ粒子（LNP）でmRNAをカプセル化することでmRNAを分解から保護し、標的細胞への封入を促します。化学反応に脂質とエタノールを使用し、その反応中にmRNAがLNPに捉えられます。LNPの大きさはおおよそ5～100 nmまで幅があり、各社のプロトコルに応じて異なります。 選択可能なポリッシング工程 を終えると、カプセル化されたmRNAの最終ろ過の準備が整います。さらに、濃縮とバッファー交換・透析 により遊離mRNAが除去されます。
mRNAツールボックス
mRNA製造プロセスの簡素化
mRNAの製造にはまだプラットフォームでのアプローチがありません。mRNAには、荷電したリン酸基と、水素結合能をもつ疎水性のヌクレオチド残基が含まれています。この幅広い化学特性が、精製カラムの多様な選択肢の基礎となっています。当社ツールボックスにより、お客様の用途に最適なmRNA製造プロセスを構築することができます：
- 様々な精製オプションが利用可能
- 分かりやすいプラグアンドプレイのアプローチ
- 大幅な最適化操作は不要
- 専門家によるテクニカルサポート
モノリス型製品の詳細
IVT混液からの優れたmRNA分離により、夾雑物を含まないサンプルが得られます。
直鎖pDNAの生成、IVT反応から精製後のmRNAに至るまで、pDNAとmRNAの製造と精製に精通しています。
当社のツールボックスは多様なバイオプロセス作業に対応しており、幅広いmRNA分子の精製を可能にします。
信頼性のあるmRNA精製のためのモノリス型カラム
mRNA分子の高分離能を得るために、モノリス型カラムの力を利用してください。
当社には、あらゆる用途に対応する、独自性と補完性を兼ね備えた化学特性により、魅力的なモノリス型カラムのラインアップが揃っています。お客様のmRNA製造プロセスに最適な組み合わせを見つけてください。
CIMmultus® Oligo dT
ハイブリダイゼーションアフィニティークロマトグラフィー
CIMmultus® Oligo dTにより、ポリアデニル化mRNAをワンステップで親和的にキャプチャーすることができます。結合は水素結合によって生じます。Oligo dTが、標的mRNA末端のポリ（A）配列と安定したハイブリッド結合を形成します。このカラムではC6とC12リンカーをご利用いただけます。
- mRNAの一次精製に便利なアプローチ
- サンプルロード中にRNA以外の夾雑物がカラムを流れ、タンパク質とDNAを効率的に除去
- 大きさや鎖の数を問わず、すべてのRNA種をキャプチャー
- 本来はmRNAキャプチャー用の設計ですが、ポリッシングにも使用可能
どのように作用するのか
CIMmultus® Oligo dTにIVT混液を添加したクロマトグラム。mRNA（青緑の線、16分あたりにピーク）とRNA以外の夾雑物（青緑の線、2分あたりにピーク）が、ワンステップで親和的に捕捉される様子を示しています。その間にカラムを洗浄し、mRNAを回収しています。破線は伝導率を示しています。
陰イオン交換
CIMmultus® PrimaS
水素結合との陰イオン交換クロマトグラフィー
PrimaSは、水素結合の要素と陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたマルチモーダルクロマトグラフィーリガンドです。CIMmultus® PrimaSは常温での一本鎖RNAの精製をサポートします。
- RNAの構造や組成を問わず、すべてのRNAをキャプチャー
- 長い一本鎖mRNA（ssRNA）を精製し、サイズで分画します
- ssRNAより前にDNAとタンパク質が溶出し、ssRNAを高い分離能で分離
- 非ポリアデニル化コンストラクトに有用
- 高分離能のキャプチャー法として、あるいはポリッシングに使用可能
どのように作用するのか
CIMmultus® PrimaSにIVT混合物を添加したクロマトグラム。 青緑色の線は、スーパーコイルDNA（scDNA、6 kb）がpHグラジエント（破線）全体でssRNA（5 kb）から分離したことを示しています。
疎水性相互作用クロマトグラフィー
CIMmultus® C4 HLD
疎水性相互作用クロマトグラフィー
C4（ブチル）High Ligand Density（HLD）は高い疎水性をもっています。サンプルを高いイオン強度の塩に添加してRNAを沈降させ、濃度を下げる塩グラジエントによってRNAを溶出させます。
- 核酸（pDNA、RNA）からのタンパク質除去にきわめて有効
- 最終精製ツールとして最良の結果を実現
- DNA、dsRNA、切断型RNAからssRNAを分離
- タンパク質と強力に結合し、サンプルからそれらを除去、タンパク質は通常NaOHを用いた洗浄ステップにより溶出します
どのように作用するのか
ポリッシング中のssRNA（青緑色の線、8分あたりにピーク）と夾雑物（青緑色の線、1分あたりにピーク）が示されています。塩濃度（破線）を下げてssRNAを豊富に含む分画を得ました。
逆相クロマトグラフィー
CIMmultus® SDVB
逆相クロマトグラフィー
CIMmultus® SDVBはスチレンジビニルベンゼン（SDVB）をベースとした逆相クロマトグラフィーを使用し、ssRNAを、切断型、dsRNA、DNAから分離します。同じ大きさの一本鎖と二本鎖を分離する際の選択性は、塩基対の程度に影響を受けます。
- ポリッシングの方法として最適
- サイズ分離も実行
- dsRNAの特性解析と、短い転写産物と未変化のssRNAの分離の際に選ぶべきツール
どのように作用するのか
CIMmultus® SDVBにRNAラダー（65°Cで変性）を添加したクロマトグラム。青緑色の線は溶出中のssRNAのサイズ分離を示しています。黒線はdsRNAを示しています。
