Producción de ARNm
Los ARN mensajeros (ARNm) son una clase de bioterapéuticos de rápida aparición. Si bien son una promesa considerable, el campo aún está en su infancia. Las terapias de ARNm ofrecen una nueva oportunidad para el tratamiento dirigido de enfermedades desafiantes y la fabricación flexible, como lo demuestra el rápido desarrollo de vacunas de ARNm contra COVID-19. El potencial clínico del ARNm se extiende más allá de las vacunas a otras terapias avanzadas, como el reemplazo de proteínas, la terapia génica y la inmunoterapia contra el cáncer. En Sartorius, nuestro viaje de ARNm comenzó con nuestras tecnologías de purificación líderes. Nuestro amplio conocimiento ahora se extiende a todo el proceso de producción de sustancias farmacológicas (SD) de ARNm.
Los ARNm son ácidos nucleicos monocatenarios transcritos a partir del ADN, que representan un componente crítico de la expresión génica. Para ejercer su función clínica, las moléculas de ARNm se envían al tejido diana, dirigiendo la producción de la proteína codificada dentro de las células. Al imitar las acciones de los ARNm endógenos, los ARNm terapéuticos evitan las propiedades inmunogénicas y los desafíos de fabricación asociados con las proteínas recombinantes terapéuticas. La expresión de ARNm también es temporal y la estabilidad de la molécula de ARNm está directamente ligada a la expresión génica; cuanto más tiempo dice el ARNm dentro de la célula, mayor es la producción de la proteína codificada.
Descubra más sobre los desafíos de la producción de ARNm y comience su viaje con nuestras herramientas de purificación.
Proceso de producción de ANRm
Del gen de interés al ARNm
La secuencia de ADN que codifica el gen de interés se inserta primero en un plásmido. El ADN plasmídico (ADNp) se amplifica en bacterias hospedadoras, típicamente E. coli, antes de purificarse y linealizarse. El ARNm se sintetiza a partir de la plantilla de ADNp, que se incuba con enzimas y nucleótidos para producir el ARNm. Este método se llama transcripción in vitro (IVT) y es un proceso sin células. Se requieren pasos adicionales para agregar la capa de ARNm y estabilizar la molécula.
La nueva molécula de ARNm se aísla luego eliminando impurezas como enzimas, nucleótidos restantes y ácidos nucleicos. Finalmente, el ARNm se concentra y se somete a filtración estéril antes de que esté listo para encapsularse en LNP.
mRNA Process Flow
La ausencia de procesos de IVT estandarizados restringe el desarrollo de una única plataforma de purificación de ARNm. Tampoco existe un proceso único para todos; por ejemplo, la selección del método de captura depende de la construcción de ARNm.
- Los ARNm son moléculas grandes e inestables sensibles al esfuerzo cortante y la degradación enzimática.
- El ARNm debe estar separado de contaminantes con propiedades similares como ARN bicatenario (ARNdc), ARNm truncado y ADN.
- Las herramientas analíticas insuficientes dificultan la capacidad de optimizar el proceso de fabricación
Síntesis de ARNm | Transcripción y tapado in vitro
Las moléculas de ARNm se sintetizan comúnmente a partir de ADNp linealizado mediante una reacción de transcripción in vitro (IVT). La reacción IVT requiere una plantilla de ADN, nucleótidos, polimerasa y enzimas de protección. La síntesis de diferentes construcciones de ARNm podría requerir condiciones únicas que podrían no alinearse con los procedimientos recomendados. Estos pueden incluir pasos de purificación intermitentes para optimizar la productividad.
Una sólida plataforma de reacción de IVT respaldada por análisis rápidos
- Materias primas bien definidas
- Contaminantes limitados introducidos en la reacción
- Procesos de transcripción eficientes que producen altas concentraciones de ARNm
En Sartorius, contamos con servicios de desarrollo de procesos líderes en la industria para optimizar sus reacciones IVT.
- Actividades de desarrollo de procesos respaldadas por un profundo conocimiento de la reacción IVT
- Fuerte experiencia en el desarrollo de cromatografía analítica para caracterizar cada paso del proceso, maximizando la productividad y garantizando la seguridad del paciente.
- Análisis rápidos de HPLC basados en CIMac PrimaS ™ para monitorear el consumo de reactivos y la tasa de producción de ARNm
- Las reacciones IVT se pueden realizar en sistemas de biorreactores cerrados para ampliar la fabricación. Nuestro Biostat STR® es un biorreactor probado en la industria con una película única y robusta para minimizar los extraíbles y lixiviables. La tecnología automatizada facilita la integración de una amplia gama de tecnologías analíticas de procesos utilizadas en aplicaciones IVT.
- La tecnología Flexsafe® Pro Mixer s la única solución de mezcla de un solo uso con sensores integrados de pH, conductividad y temperatura. Con capacidad para aplicaciones de mezcla rápida y de bajo cizallamiento en un diseño completamente cerrado, el mezclador es ideal para la mezcla de bajo cizallamiento de moléculas frágiles como el ARNm.
Captura de ARNm
Durante la captura de ARNm, se purifica el ARNm y se eliminan los reactivos IVT (incluidos los nucleótidos, el ADNp y las enzimas). La captura de ARNm se realiza habitualmente mediante cromatografía, basándose en interacciones de afinidad o las propiedades químicas de la molécula de ARNm. Sin embargo, las propiedades del ARNm, incluido su gran tamaño, la similitud con otros contaminantes y la inestabilidad, pueden obstaculizar el éxito de su aislamiento. Además, la lenta adopción de tecnologías de purificación escalables también obliga a depender de métodos de purificación a escala de laboratorio, incluso a gran escala. Las columnas monolíticas ofrecen una alta velocidad de flujo y logran una alta eliminación de impurezas en un modo de unión-elución, lo que facilita la captura eficiente de ARNm.
Tecnologías de purificación eficientes y escalables capaces de separar en alta resolución el ARNm de las impurezas, incluidas aquellas con composiciones químicas similares.
- Capacidad suficiente para mejorar la productividad
- Sistemas plug-and-play con rendimiento rápido
- Soluciones flexibles aplicables a cualquier proceso productivo
- Alta recuperación de moléculas de ARNm
Sartorius ofrece soluciones integrales de captura de ARNm basadas en tecnología monolítica, junto con soporte de desarrollo de procesos para ayudar a optimizar la recuperación de ARNm.
- Múltiples opciones de purificación disponibles, basadas en la presencia de una polyA tail o ausencia de una polyA tail
- Alta capacidad de unión dinámica para ARNm (hasta 3 y 10 mg / ml usando OligodT y PrimaS, respectivamente)
- Fuerzas de corte bajas para una recuperación máxima con una excelente eliminación de contaminantes
- Supere las preocupaciones de fabricación, como la necesidad de altas temperaturas o disolventes orgánicos.
Explore las herramientas de mRNA Consulte con nuestros expertos
El sistema de cromatogradía single-use Allegro está diseñado para producción piloto, clínica y comercial. El diseño modular flexible permite la operación de columna monolítica con opciones de configuración isocrática o de gradiente.
Consulte con nuestros expertos
Pulido de ARNm
El pulido se puede utilizar para apuntar a las impurezas restantes, incluidas las proteínas, el dsRNA y los RNA truncados, que quedan después de la captura del mRNA. En un campo de rápida evolución como la terapéutica de ARNm, necesita herramientas integrales para eliminar todo tipo de material contaminante, asegurando que su molécula cumpla con los requisitos de calidad necesarios para aplicaciones clínicas.
Soluciones flexibles y escalables que permiten la eliminación de contaminantes residuales en alta resolución.
- Alta capacidad de unión para ARNm
- Capacidad para discriminar incluso moléculas muy similares (como separar mRNA de dsRNA)
Sartorius ofrece soluciones de pulido de ARNm a través de nuestra gama de tecnologías monolíticas
- Eliminación flexible y dirigida de impurezas residuales mediante intercambio aniónico, fasae inversa o interacciones hidrófobas
- Evite la necesidad de altas temperaturas y disolventes orgánicos, que pueden ser un cuello de botella en la fabricación.
- Alta capacidad de unión dinámica para ARNm y procedimientos de bajo cizallamiento para maximizar el rendimiento.
- Resolución superior con un mínimo ensanchamiento de picos
Explore las herramientas mRNA Consulte a nuestros expertos
El sistema de cromatografía single-use Allegro está diseñado para producción piloto, clínica y comercial. El diseño modular flexible permite la operación de columna monolítica con opciones de configuración isocrática o de gradiente.
Concentración, diafiltración y filtración estéril
Los pasos de concentración y diafiltración reducen el volumen de la muestra y eliminan las moléculas pequeñas del tampón. Esto se puede realizar en varias etapas a lo largo del procedimiento. Durante los pasos finales, el ARNm purificado se somete a filtración estéril.
Métodos de filtración suaves compatibles con la sensibilidad del ARNm a la degradación y al esfuerzo cortante.
- Máxima recuperación de ARNm a pesar de su inestabilidad
- Mitiga el riesgo de introducir nuevos contaminantes, como RNasa, en el producto final.
Sartorius ofrece soluciones de purificación intuitivas y fáciles de usar para la concentración y diafiltración de ARNm con características que incluyen un formato de casete irradiable con rayos gamma. Hydrosart® es una smembrana de flujo cruzado de última generación diseñada para una baja adsorción de ARNm y garantiza la compatibilidad con cualquier aplicación.
- Disponibles membranas con límites de peso molecular de 2 kD a 300 kD
- Proporciona baja adsorción, alta velocidad de flujo y mayor recuperación de producto.
- Resistente a productos químicos, vapor, calor e irradiación gamma, y se puede utilizar con una concentración de etanol de hasta el 40%, lo que permite una amplia gama de condiciones de funcionamiento con poca suciedad.
- Las Sartocon® Self Contained Units (0.1m² to 14m²) se pueden entregar gamma estériles, lo que facilita el procesamiento cerrado, escalable y listo para usar
- Sartopore® ofrece la gama más amplia de combinaciones de membranas de PES, adaptándose perfectamente a todos los tipos de productos con los costos de filtración más bajos. Disponibles con tamaños de poro de 0,2 o 0,45 µm, estas membranas permiten una filtración estéril con una alta tasa de retención. Los conjuntos de transferencia prediseñados y configurables se entregan irradiados con rayos gamma.
- Una amplia gama de sistemas de flujo cruzado cubren las necesidades de desarrollo de procesos hasta la producción comercial a gran escala, con la opción de implementar soluciones funcionalmente cerradas con rutas de flujo irradiadas con rayos gamma y de un solo uso.
Almacenamiento y transporte de sustancias farmacéuticas
Los productos bioterapéuticos son productos valiosos y, a menudo, sensibles que requieren un manejo cuidadoso durante la producción, el almacenamiento y el traslado a otras instalaciones. El diseño detallado de los métodos de almacenamiento y transporte de sustancias farmacéuticas es esencial para proteger la integridad del producto y garantizar la seguridad del paciente. Muchos productos farmacéuticos, incluidos los terapéuticos de ARNm, se almacenan en estado congelado para ralentizar la degradación química y biológica, extender la vida útil del producto, restringir el crecimiento microbiano y prevenir la agitación excesiva por el esfuerzo cortante.
Soluciones de almacenamiento y transporte congeladas que protegen las moléculas de ARNm sensibles
- Soluciones robustas y confiables para limitar las fluctuaciones ambientales y preservar el producto
- Sistemas seguros, seguros y rastreables para rastrear el ARNm a lo largo de su viaje.
- Efectos limitados de la crioconcentración
Nuestra gama Celsius® incluye productos de un solo uso, irradiados con rayos gamma y listos para usar para garantizar la conservación y transferencia segura y sencilla del material biológico congelado.
Celsius® CFT: nuestra plataforma de congelación / descongelación totalmente integrada
- Tecnología de congelación de placas controlada verticalmente robusta, escalable, reproducible y fácil de usar con un historial establecido
- Congelación rápida controlada y rápida y descongelación con agitación para mitigar el efecto de crioconcentración observado en los procesos de congelación y descongelación a gran escala.
- Gran capacidad (hasta 100 L)
Celsius® S3 – un sistema sobremesa totalmente escalable para la producción comercial.
- La misma longitud de trayectoria de congelación y tecnología de intercambio de calor como soluciones a gran escala, lo que significa que los protocolos de congelación / descongelación son transferibles
Celsius® FFTp preensamblado y listo para llenar contenedores de un solo uso para aprovechar la infraestructura existente.
- Alta robustez garantizada por nuestra innovadora tecnología SafecoreTM, los contenedores, y Celsius® FFT/FFTp containers están totalmente calificados hasta -80 ° C contra las peores condiciones de envío
- Celsius® FFT se puede utilizar con cualquier congelador convencional, y Celsius® FFTp está diseñado explícitamente para congeladores de placas.
Las nanopartículas lipídicas (LNP) encapsulan el ARNm, protegiéndolo de la degradación y promoviendo su entrega a las células diana. Los lípidos y el etanol se utilizan en la reacción química, durante la cual se captura el ARNm en el LNP. El tamaño del LNP varía según el protocolo de la empresa, que varía entre 5 y 100 nm.Después de un paso de pulido opcional, el ARNm encapsulado está listo para la filtración final y el ARNm libre se elimina por concentración y diafiltración.
Caja de herramientas del ARNm
Simplifique su proceso de producción de ARNm
La producción de ARNm aún no es un enfoque de plataforma. El ARNm contiene un esqueleto de fosfato cargado y residuos de nucleótidos hidrófobos con capacidad para formar puentes de hidrógeno; su rico espectro de propiedades químicas es la base para una diversa selección de columnas de purificación. Nuestra caja de herramientas de soluciones le permite construir un proceso de producción de ARNm que mejor se adapte a su aplicación:
- Varias opciones de purificación disponibles
- Enfoque sencillo plug-and-play
- No requiere una optimización significativa
- Soporte técnico experto disponible
Explore Monolitos
La separación superior del ARNm de la mezcla IVT significa que sus muestras están libres de contaminantes
Expertos en la producción y purificación de pDNA y mRNA, desde la producción linealizada de pDNA y reacciones IVT hasta el mRNA purificado
Nuestra caja de herramientas es compatible con diversas actividades de bioprocesamiento y permite la purificación de un amplio espectro de moléculas de ARNm.
Monolithic Columns for Reliable mRNA Purification
Harness the power of monoliths for high-resolution isolation of mRNA molecules.
Our range of monolithic columns are powered by distinct but complementary chemistries to suit any application. Discover the combination that works best for your mRNA production process.
CIMmultus® Oligo dT
Cromatografía de afinidad de hibridación
CIMmultus® Oligo dT permite una captura de afinidad de un solo paso de ARNm poliadenilado. La unión se produce mediante enlaces de hidrógeno, y el Oligo dT forma una asociación híbrida estable con la secuencia terminal poli (A) del ARNm diana. La columna está disponible con enlazadores C6 y C12.
- Enfoque conveniente para la purificación inicial de ARNm
- Los contaminantes que no son ARN fluyen a través de la columna durante la carga de la muestra, eliminando de manera eficiente proteínas y ADN
- Captura todas las especies de ARN, independientemente del tamaño o el varamiento
- Diseñado principalmente para la captura de ARNm, pero también se puede usar durante el pulido
¿Como funciona?
Cromatograma de mezcla IVT aplicada a CIMmultus® Oligo dT. El ARNm (línea verde azulado, pico alrededor de 16 min) y los contaminantes que no son ARN (línea verde azulado, pico alrededor de 2 minutos) se muestran en una captura de afinidad de un solo paso, durante la cual se lava la columna y se recupera el ARNm. La línea discontinua muestra la conductividad.
Intercambio de aniones
CIMmultus® PrimaS
Cromatografía de intercambio aniónico con enlace de hidrógeno
PrimaS es un ligando de cromatografía multimodal que combina elementos de enlace de hidrógeno con cromatografía de intercambio aniónico. CIMmultus® PrimaS apoya la purificación de ARN monocatenario a temperatura ambiente.
- Captura todos los ARN independientemente de su estructura o composición.
- Purifica y selecciona el tamaño de ARNm de cadena simple grande (ARNm)
- El ADN y las proteínas eluyen antes y están bien separados del ssRNA
- Útil para construcciones no poliadeniladas
- Puede utilizarse como método de captura de alta resolución o para pulir
¿Como funciona?
Cromatograma de mezcla IVT aplicado a CIMmultus® PrimaS. La línea verde azulado muestra que el ADN superenrollado (ADNcc, 6 kb) se separa del ARN ss (5 kb) a través de un gradiente de pH (línea discontinua).
Interacción hidrofóbica
CIMmultus® C4 HLD
Cromatografía de interacción hidrofóbica
C4 (butil) High Ligand Density (HLD) es fuertemente hidrófobo. La muestra se aplica a una fuerza iónica alta en sales que precipitan el ARN y el ARN se eluye con un gradiente salino decreciente.
- Muy eficaz para eliminar proteínas de ácidos nucleicos (pDNA, RNA)
- Mejores resultados como herramienta de pulido
- Separa ssRNA de DNA, dsRNA y RNA truncado
- Se une fuertemente a las proteínas, eliminándolas de la muestra.
- Proteínas eluidas típicamente mediante el paso de limpieza con NaOH
¿Como funciona?
Cromatograma de mezcla IVT aplicada a CIMmultus® C4 HLD. El ssRNA (línea verde azulado, pico alrededor de 8 min.) y los contaminantes (línea verde azulado, pico alrededor de 1 min) se muestran durante el pulido, donde las concentraciones de sal (línea discontinua) se moderan para enriquecer el ssRNA.
Fase inversa
CIMmultus® SDVB
Cromatografía de fase inversa
CIMmultus® SDVB utiliza cromatografía de fase inversa basada en estireno-divinilbenceno (SDVB) para separar ssRNA de formas truncadas, dsRNA y DNA. Su selectividad para la separación de especies monocatenarias y bicatenarias de tamaño similar está influenciada por el grado de apareamiento de bases.
- Más adecuado como método de pulido
- También realiza separación de tamaño
- Herramienta de elección para caracterizar dsRNA y discriminar ssRNA intacto de transcripciones cortas
¿Como funciona?
Cromatograma de escaleras de ARN (desnaturalizado a 65 ° C) aplicado a CIMmultus® SDVB. La línea verde azulado muestra la separación de tamaño del ssRNA durante la elución. La línea negra muestra dsRNA.
