ADN plásmido (pDNA)
El ADN plasmídico (ADNp) representa un punto de partida fundamental para muchas actividades de ingeniería genética, incluido el desarrollo de proteínas recombinantes, vectores virales y bioterapéuticos avanzados. El progreso continuo en la terapia génica y la terpéutica basadas en DNA/RNA ha llevado a una creciente demanda de procesos de producción de ADNp confiables adecuados para aplicaciones clínicas.
Los plásmidos son moléculas circulares de ADN que se encuentran naturalmente en las bacterias. Se replican de forma independiente (episomal) del ADN genómico bacteriano, una propiedad que los hace ideales como vector para la ingeniería genética. El pDNA purificado se puede utilizar como materia prima en procesos como la producción de vectores adenoasociados (AAV) y lentivirales, reacciones de transcripción in vitro (IVT) durante mproducción de mRNA, y transferencia genética directa.
Sartorius proporciona varias herramientas para una fabricación eficiente a lo largo de la producción de pDNA. Explore el proceso de fabricación de ADN plasmídico desde bacterias hasta la filtración final a continuación y descubra las soluciones que lo guiarán en cada paso.
Recuperar altos rendimientos de pDNA puede ser complicado debido a su tamaño, sensibilidad al cizallamiento y similitud con algunos contaminantes.
- Los cultivos de células de alta densidad suelen ser difíciles de controlar, mantener y cosechar.
- Las fuerzas de cizallamiento pueden dañar el pDNA y degradar el DNA genómico precipitado, contaminando el extracto de plásmido.
- Los plásmidos grandes (> 6 kb) son difíciles de purificar utilizando métodos tradicionales como las resinas, ya que no pueden difundirse con éxito a través de los poros.
- Separar el pDNA de los contaminantes (incluidas las isoformas de plásmido no deseados) para obtener un producto homogéneo puede ser técnicamente exigente y, a menudo, requiere múltiples pasos de cromatografía.
Proceso de producción de ADNp
De E. coli al plásmido purificado
El gen de interés se inserta en el pDNA, que se introduce en la bacteria huésped (típicamente E. coli) en un proceso llamado transformación, generalmente por electroporación. Las células huésped se replican durante la fermentación, haciendo copias del plásmido y produciendo altos rendimientos de la secuencia deseada. Una vez que las células han alcanzado la densidad deseada, se recolectan y se extrae el pDNA, típicamente mediante lisis alcalina. A continuación, se clarifica el lisado y se purifica el pDNA mediante cromatografía. Finalmente, el plásmido se concentra y filtra antes de someterlo a medidas de control de calidad para garantizar que el producto tenga la pureza suficiente.
pDNA Process Flow
Las bacterias hospedadoras se expanden para producir millones de copias del pDNA.
El objetivo del procesamiento aguas arriba en la producción de plásmidos es generar tanto ADNp como sea posible utilizando una población de células huésped. Normalmente, E. coli se usa debido a su capacidad para proliferar y producir altos rendimientos del pDNA rápidamente. Se selecciona un clon de alta producción y se usa para formar el tren de semillas, que proporciona un número de células adecuado para inocular el biorreactor de producción. Después del cultivo, las células se recolectan, generalmente por centrifugación.
Las bacterias hospedadoras se expanden para producir millones de copia...
Una plataforma de producción escalable para optimizar el crecimiento celular y maximizar el rendimiento de plásmidos de una manera simple y confiable
- Producción robusta, controlable y eficiente
- Un tren de semillas estéril para evitar la contaminación cruzada
- Bombas de alimentación de alta velocidad
Sartorius ofrece una gama de soluciones para la fermentación microbiana en todas las escalas de producción.
Biostat® D-DCU s un sistema de bioproceso compacto con tamaños de recipiente de 10 a 200 L, que cumple con los requisitos para la fermentación de alta densidad de E. coli (> 50 OD).
- Una película única y robusta en todo el proceso para optimizar las condiciones de crecimiento celular.
- Integración de una amplia gama de tecnología analítica de procesos (PAT), incluidos BioPAT Trace y
- Flexibilidad y escalabilidad total desde Ambr® hasta el reactor de tanque agitado (STR) para un rápido desarrollo del proceso
- Mycap CCX: Un sistema de expansión de cultivo celular que le permite hacer crecer y pasar células sin tener que abrir un matraz o ingresar a un gabinete de bioseguridad
- Ambr® 250: Biorreactores multiparalelos de single-use que se pueden adaptar para la fermentación microbiana para acelerar el desarrollo del proceso.
- Los cartuchos de fibra hueca de un solo uso dentro de nuestra Green Line apoyan la recolección de células de cultivos de alta densidad.y cultures.
Las células huésped se lisan para liberar el pDNA
El objetivo de la lisis celular es liberar ADNp y eliminar los restos celulares y el ADN genómico. Una vez que se recolectan las células huésped, el sedimento celular se lisa con una solución de NaOH y posteriormente se neutraliza con acetato de potasio. El precipitado resultante contiene impurezas, incluidas las proteínas de la célula huésped y el ADN.
Eliminación inicial de restos celulares de pDNA
El material recogido de la lisis alcalina contiene pDNA así como contaminantes de las células huésped. La clarificación purifica el pDNA de cultivos celulares de alta densidad, eliminando los restos celulares y las impurezas.
Soluciones óptimas de clarificación de pDNA que separan las impurezas incluso de los lisados celulares de mayor densidad
- Las herramientas deben poder manejar soluciones altamente viscosas.
Sartorius ofrece una amplia gama de consumibles de filtración de flujo tangencial (TFF), que cubren aplicaciones desde el desarrollo de procesos hasta la producción comercial a gran escala. Nuestros módulos de fibra hueca Green Line ofrecen una plataforma totalmente escalable para la clarificación de lisados celulares, especialmente en entornos de alta densidad celular. Las membranas de microfiltro Hydrosart® 0.2µm Microfilter membranes se recomiendan para concentraciones celulares medias o bajas.
- Membrana que ofrece un corte de peso molecular de 3 kD a 750 kD y un tamaño de poro de 0,1 μm a 0,65 μm
- Irradiado con rayos gamma; De un solo uso y listo para usar, lo que ahorra tiempo y costos asociados con la configuración del equipo.
- Particularmente eficaz para lisados viscosos de cultivos de alta densidad celular
- La familia Sartopore® 2 ofrece la gama más amplia de combinaciones de membranas PES que se adaptan perfectamente a todos los tipos de productos para obtener los costos de filtración más bajos.
- Sartorius ofrece una amplia gama de sistemas TFF, que cubren aplicaciones desde el desarrollo de procesos hasta la producción comercial a gran escala. Nuestras soluciones tienen la opción de implementar soluciones funcionalmente cerradas con rutas de flujo de un solo uso e irradiadas con rayos gamma.
El volumen de la muestra se reduce y las moléculas pequeñas se eliminan del tampón.
La concentración de pDNA, la eliminación de contaminantes y los pasos de intercambio de tampón son esenciales en la producción de pDNA, pero pueden ser un desafío debido al gran tamaño y la sensibilidad al cizallamiento del pDNA. Las últimas innovaciones combinan operaciones de bajo cizallamiento y procesamiento completamente cerrado para permitir la mayor recuperación en un sistema contenido, creando un entorno ideal para la fabricación de pDNA.
Soluciones de concentración a medida para moléculas grandes y sensibles
- Cizallamiento limitado para minimizar la degradación y la mala recuperación
- Recuperación máxima incluso de las construcciones más grandes
Sartorius ofrece una sólida cartera de productos adecuados para la concentración / diafiltración de biomoléculas. Nuestros conjuntos de flujo de fibra hueca de un solo uso Green Line representan un sistema totalmente escalable para concentrar pDNA
- Gama de tamaños para soportar la filtración de plásmidos grandes (hasta 750 kb). La investigación recomienda entre 30 kD y 750 kD MWCO.
- Irradiado con rayos gamma y listo para usar, lo que reduce los tiempos de proceso
- Operaciones de bajo cizallamiento
- La familia Sartopore® 2 incluye la gama más amplia de combinaciones de membranas PES que se adaptan perfectamente a todo tipo de productos para los menores costos de filtración.
Aislamiento de ADN plasmídico
Como producto biofarmacéutico, el pDNA está sujeto a estrictos requisitos de pureza, eficacia y rendimiento. La captura de pDNA es un paso crítico en el proceso posterior, que elimina la mayoría de los contaminantes mientras se concentra el pDNA.
Procesos de captura de ADNp que son sensibles, de bajo cizallamiento y adecuados para moléculas grandes.
- Eliminación eficaz y suave de impurezas para evitar su degradación.
- Métodos de captura sin restricciones de tamaño
El HIP² Plasmid Process Pack™ es una solución integral para la purificación de pDNA desarrollada por científicos expertos de Sartorius.
Las columnas CIMmultus® DEAE representan el primer paso de nuestra plataforma plug and play para una purificación eficaz de pDNA
- Concentra el pDNA y elimina la mayoría de las proteínas de la célula huésped y otros ácidos nucleicos.
- Alta capacidad de unión dinámica para pDNA
- Las fuerzas de corte bajas maximizan la recuperación de pDNA
- Nuestro protocolo sencillo y detallado respalda el desarrollo de un proceso sólido
- El sistema de cromatograía single-use Allegro está diseñado para producción piloto, clínica y comercial. El diseño modular flexible permite el funcionamiento de la columna y la membrana con opciones de configuración isocrática o en gradiente
Separación de isoformas de plásmido para producir ADNp homogéneo.
Se requiere un paso adicional de cromatografía de pulido para separar las isoformas de pDNA, generalmente para aislar pDNA superenrollado (SC) de DNA circular abierto (OC) y lineal. El pDNA farmacéutico tiene requisitos estrictos de pureza, homogeneidad y eficacia, y el pDNA SC es la forma más estable, eficiente y biológicamente activa.
Soluciones de cromatografía de pulido eficientes y robustas que producen extractos de ADNp homogéneos de manera confiable
- Los métodos deben ser lo suficientemente sensibles para separar las isoformas del plásmido.
El HIP² Plasmid Process Pack™ de Sartorius es una completa solución de purificación de pDNA.
Las columnas CIMmultus® C4 HLD forman el segundo paso del HIP² Plasmid Process Pack™
- Separa las isoformas de pDNA lineales y circulares abiertas (OC) del pDNA superenrollado (SC)
- La alta capacidad de unión dinámica y el bajo cizallamiento maximizan la recuperación de pDNA
- Ofrece flexibilidad y escalabilidad
- El sistema de cromatografía de un solo uso Allegro está diseñado para producción piloto, clínica y comercial. El diseño modular flexible permite el funcionamiento de la columna y la membrana con opciones de configuración isocrática o en gradiente
El volumen de la muestra se reduce y las moléculas pequeñas se eliminan del tampón.
La concentración de pDNA, la eliminación de contaminantes y los pasos de intercambio de tampón son esenciales en la producción de pDNA, pero pueden ser un desafío debido al gran tamaño y la sensibilidad al cizallamiento del pDNA. Las últimas innovaciones combinan operaciones de bajo cizallamiento y procesamiento completamente cerrado para permitir la mayor recuperación en un sistema contenido, creando un entorno ideal para la fabricación de pDNA.
Soluciones de concentración a medida para moléculas grandes y sensibles
- Cizallamiento limitado para minimizar la degradación y la mala recuperación
- Recuperación máxima incluso de las construcciones más grandes
Sartorius ofrece una sólida cartera de productos adecuados para la concentración / diafiltración de biomoléculas. Nuestros conjuntos de flujo de fibra hueca de un solo uso Green Line representan un sistema totalmente escalable para concentrar pDNA
- Gama de tamaños para soportar la filtración de plásmidos grandes (hasta 750 kb). La investigación recomienda entre 30 kD y 750 kD MWCO.
- Irradiado con rayos gamma y listo para usar, lo que reduce los tiempos de proceso
- Operaciones de bajo cizallamiento
- La familia Sartopore® 2 incluye la gama más amplia de combinaciones de membranas PES que se adaptan perfectamente a todo tipo de productos para los menores costos de filtración.
El pDNA aislado se somete a filtración estéril para evitar la contaminación microbiana.
El último paso de filtración estéril es fundamental para prevenir la contaminación microbiana y garantizar la seguridad del paciente. Las estrategias innovadoras de mitigación de riesgos protegerán la integridad de toda la operación, desde el último paso de filtración hasta el almacenamiento en bolsas de un solo uso.
Soluciones de filtración estériles aplicables a moléculas de ADNp grandes sensibles al cizallamiento
- Apto para soluciones viscosas
Sartorius ofrece los filtros estériles más avanzados para su aplicación. La familia Sartopore® 2 incluye la gama más amplia de combinaciones de membranas PES que se adaptan perfectamente a todo tipo de productos para los menores costos de filtración.
- Disponible con un tamaño de poro de membrana final de 0,2 o 0,45 µm
- Integrado en el juego de transferencia de filtro para aplicaciones cerradas de un solo uso
- Sartopore® Platinum es la opción ideal para aplicaciones de llenado final. La modificación única de la superficie de la membrana PES proporciona la adsorción más baja, lo que facilita un alto rendimiento del producto y una humectación segura para pruebas de integridad confiables.
- Sartocheck 5 es el punto de referencia para las pruebas de integridad de filtros de grado esterilizante. La unidad está diseñada para proporcionar seguridad e integridad de datos intuitiva y líder en la industria con los más altos estándares de gestión de riesgos cuantitativos (QRM) para pruebas.
Los análisis son necesarios para determinar la presencia de impurezas y cuantificar el producto a lo largo del proceso de purificación de pDNA. La información proporcionada respalda el control del proceso, la solidez y la alta calidad del producto.
Una solución de análisis que proporciona una evaluación completa de la muestra de pDNA
- Proporcione rápidamente una imagen completa del producto final
- Evite los métodos que requieren mucha mano de obra
Sartorius ofrece soluciones completas para monitorizar y controlar sus muestras de pDNA.
Nuestra CIMac™ pDNA 0.3 mL Analytical Columns están diseñadas para el monitoreo y la cuantificación rápida y reproducible de HPLC de plásmido de ADN, así como para la separación de diferentes isoformas de plásmido de ADN.
- Diseñado principalmente para el control en proceso y final de muestras de pDNA en varias etapas del proceso de purificación,
- También se puede utilizar para determinar la presencia de ARN y endotoxinas.
- Análisis rápido de alta resolución
- Separación independiente del flujo
- Alta sensibilidad y reproducibilidad.
- El sistema PATfix™ HPLC le brinda un análisis "en línea" para el control de impurezas y componentes de calidad críticos mediante el uso de huellas digitales de HPLC
CIMmultus® HiP2 Plasmid Process Pack™
CIMmultus® HiP2 Plasmid Process Pack™
Creamos un paquete de purificación de pDNA listo para usar para ayudar a los científicos a desarrollar su propio proceso de purificación de pDNA y transferirlo a producción. La plataforma HiP2 facilita la recuperación eficiente de pDNA en solo dos pasos de cromatografía (cromatografía de intercambio aniónico seguida de cromatografía de interacción hidrófoba).
- Eficiente: elimina la mayoría de los contaminantes (ARN, ADN genómico, proteínas de la célula huésped y endotoxinas) y aísla el ADNp superenrollado
- El procesamiento rápido se completa en unas pocas horas, lo que aumenta la productividad y minimiza los costos de fabricación. Un protocolo bien definido le ayuda a desarrollar rápidamente procedimientos de purificación sólidos.
- Escalable: las propiedades únicas de las columnas monolíticas facilitan la transferencia perfecta entre los niveles de producción, desde el laboratorio a pequeña escala hasta la purificación industrial a gran escala de pDNA.
Obtenga más información sobre cómo los monolitos realizan la cromatografía de pulido durante la purificación de pDNA
La excelente eliminación de todas las impurezas produce muestras de pDNA homogéneas y de alta pureza, incluida la separación de isoformas
Realice un procesamiento rápido sin comprometer la recuperación y la capacidad, incluso para plásmidos grandes.
La caja de herramientas contiene dos columnas listas para usar y un protocolo detallado para una incorporación rápida y sencilla a su proceso
Products in the CIMmultus® HiP2 Plasmid Process Pack™
CIMmultus® DEAE
Cromatografía de intercambio aniónico
Utilizando una cromatografía de intercambio aniónico débil, la dietilamina CIMmultus® diethylamine (DEAE) concentra el pDNA y elimina la mayoría de las proteínas contaminantes de la célula huésped, el mRNA y el DNA genómico.
Realiza la captura inicial en el paquete de proceso de plásmido de dos pasos
Puede utilizarse para procesar lisados clarificados o plásmidos parcialmente purificados de otros métodos de purificación.
Alta capacidad para moléculas de pDNA, que se concentran en un solo pico.
La mayoría de las impurezas no se unen (con la excepción del ARN, que eluye después del primer aumento de NaCl)
El tamaño del pDNA no es un factor limitante
Para pDNA de más de 11 kb, recomendamos canales de 6 μm
¿Como funciona?
Cromatograma de extracto de pDNA aplicado a CIMmultus® DEAE. El pDNA se aísla eficazmente del RNA y otros contaminantes.
Interacción hidrofóbica
CIMmultus® C4 HLD
Cromatografía de interacción hidrofóbica
La columna monolítica modificada con butilo de alta densidad de ligando (HLD) CIMmultus® C4 elimina el ADN genómico restante, las endotoxinas y las isoformas de ADNp lineales y circulares abiertas (OC), aislando el ADNp superenrollado (SC).
Realiza el paso de pulido en el paquete de proceso de plásmido de dos pasos
La unión de pDNA promovida bajo altas concentraciones de sal.
El resto de contaminantes que no son de ADN se eliminan.
Facilita la separación del pDNA superenrollado de otras isoformas
La purificación de pDNA se puede realizar tanto en el modo de unión-elución como en el de desplazamiento de la muestra
¿Como funciona?
Cromatograma de pDNA capturado aplicado a CIMmultus® C4 HLD. Los contaminantes restantes se eliminan y el pDNA de SC se aísla eficazmente del pDNA de OC.
Recursos
In-Process Control of pDNA Production on CIMac™ pDNA Analytical Column
PDF | 463.7 KB
Comparison of HIC Monolithic Support for Sample Displacement Chromatography of pDNA
PDF | 468.2 KB
