Produção de mRNA
RNAs mensageiros (mRNAs) são uma classe emergente de bioterapêuticos. Embora sejam uma promessa considerável, o campo ainda está em sua infância. As terapias de mRNA oferecem uma nova oportunidade para o tratamento direcionado de doenças desafiadoras e fabricação flexível, conforme demonstrado pelo rápido desenvolvimento de vacinas de mRNA contra COVID-19. O potencial clínico do mRNA se estende além das vacinas para outras terapias avançadas, como substituição de proteínas, terapia gênica e imunoterapia contra o câncer. Na Sartorius, nossa jornada de mRNA começou com nossas tecnologias de purificação líderes. Nosso conhecimento abrangente agora se estende a todo o processo de produção da substância medicamentosa do mRNA (DS).
Os mRNAs são ácidos nucleicos de fita simples transcritos do DNA, representando um componente crítico da expressão gênica. Para exercer sua função clínica, moléculas de mRNA são entregues ao tecido-alvo, direcionando a produção da proteína codificada no interior das células. Ao mimetizar as ações de mRNAs endógenos, os mRNAs terapêuticos evitam as propriedades imunogênicas e os desafios de fabricação associados às proteínas recombinantes terapêuticas. A expressão do mRNA também é temporária, e a estabilidade da molécula de mRNA está diretamente ligada à expressão do gene; quanto mais tempo o mRNA diz dentro da célula, maior é a produção da proteína codificada.
Descubra mais sobre os desafios da produção de mRNA e comece sua jornada com nossa caixa de ferramentas de purificação.
Processo de produção de mRNA
Do gene de interesse ao mRNA
A sequência de DNA que codifica para o gene de interesse é primeiro inserida em um plasmídeo. O DNA plasmídico (pDNA) é amplificado em bactérias hospedeiras, tipicamente E. coli, antes de ser purificado e linearizado. O mRNA é sintetizado a partir do molde de pDNA, que é incubado com enzimas e nucleotídeos para produzir o mRNA. Este método é chamado de transcrição in vitro (IVT) e é um processo livre de células. Outras etapas são necessárias para adicionar a tampa do mRNA e estabilizar a molécula.
A nova molécula de mRNA é então isolada removendo impurezas como enzimas, nucleotídeos remanescentes e ácidos nucléicos. Finalmente, o mRNA é concentrado e sujeito a filtração estéril antes de estar pronto para ser encapsulado em LNPs.
mRNA Process Flow
A ausência de processos de IVT padronizados restringe o desenvolvimento de uma única plataforma de purificação de mRNA. Também não existe um processo único para todos; por exemplo, a seleção do método de captura depende da construção de mRNA.
- Os mRNAs são moléculas grandes e instáveis, sensíveis ao estresse de cisalhamento e degradação enzimática
- O mRNA deve ser separado de contaminantes com propriedades semelhantes, como RNA de fita dupla (dsRNA), mRNA truncado e DNA
- Ferramentas analíticas insuficientes impedem a capacidade de otimizar o processo de fabricação
Síntese de mRNA | Transcrição e nivelamento in vitro
As moléculas de mRNA são comumente sintetizadas a partir de pDNA linearizado por uma reação de transcrição in vitro (IVT). A reação IVT requer um molde de DNA, nucleotídeos, polimerase e enzimas de proteção. A síntese de diferentes construções de mRNA pode exigir condições únicas que podem não se alinhar com os procedimentos recomendados. Isso pode incluir etapas de purificação intermitentes para otimizar a produtividade.
Uma plataforma de reação IVT robusta suportada por análises rápidas
- Matérias-primas bem definidas
- Contaminantes limitados introduzidos na reação
- Processos de transcrição eficientes produzindo altas concentrações de mRNA
Na Sartorius, temos serviços de desenvolvimento de processos líderes do setor para otimizar suas reações de IVT.
- Atividades de desenvolvimento de processo apoiadas por uma compreensão profunda da reação IVT
- Forte experiência no desenvolvimento de cromatografia analítica para caracterizar todas as etapas do processo, maximizando a produtividade e garantindo a segurança do paciente
- Análise rápida de HPLC baseada em CIMac PrimaS™ para monitorar o consumo de reagentes e a taxa de produção de mRNA
- As reações IVT podem ser realizadas em sistemas de biorreator fechados para aumentar a escala de fabricação. Nosso Biostat STR® é um biorreator comprovado pela indústria com um filme único e robusto para minimizar extraíveis e lixiviáveis. A tecnologia automatizada facilita a integração de uma ampla gama de tecnologias analíticas de processo usadas em aplicações IVT.
- A tecnologia Flexsafe® Pro Mixer é a única solução de mistura de uso único com sensores integrados para pH, condutividade e temperatura. Acomodando aplicações de baixo cisalhamento e de mistura rápida em um design totalmente fechado, o misturador é ideal para a mistura de baixo cisalhamento de moléculas frágeis como mRNA.
Captura de mRNA
Durante a captura do mRNA, o mRNA é purificado e os reagentes IVT (incluindo nucleotídeos, pDNA e enzimas) são removidos. A captura de mRNA é geralmente realizada por cromatografia, com base nas interações de afinidade ou nas propriedades químicas da molécula de mRNA. No entanto, as propriedades do mRNA, incluindo seu grande tamanho, semelhança com outros contaminantes e instabilidade, podem dificultar o sucesso de seu isolamento. Além disso, a lenta adoção de tecnologias de purificação escalonáveis também força a dependência de métodos de purificação em escala de laboratório, mesmo em grandes escalas. As colunas monolíticas oferecem uma alta taxa de fluxo e alcançam alta remoção de impurezas em um modo de eluição de ligação, facilitando a captura de mRNA eficiente.
Tecnologias de purificação eficientes e escaláveis capazes de separação de alta resolução de mRNA de impurezas, incluindo aquelas com composições químicas semelhantes.
- Capacidade suficiente para aumentar a produtividade
- Sistemas plug-and-play com desempenho rápido
- Soluções flexíveis aplicáveis a qualquer processo de produção
- Alta recuperação de moléculas de mRNA
A Sartorius oferece soluções abrangentes de captura de mRNA com base na tecnologia de monólito, juntamente com suporte de desenvolvimento de processo para ajudar a otimizar sua recuperação de mRNA.
- Múltiplas opções de purificação disponíveis, com base na presença de uma polyA tail ou ausência de uma polyA tail
- Alta capacidade de ligação dinâmica para mRNA (até 3 e 10 mg / ml usando OligodT e PrimaS, respectivamente)
- Baixas forças de cisalhamento para máxima recuperação com excelente remoção de contaminantes
- Superar preocupações de fabricação, como a necessidade de altas temperaturas ou solventes orgânicos
Explore ferramentas de mRNA Consulte nossos especialistas
O Asistema de cromatografia single-use Allegro foi projetado para produção piloto, clínica e comercial. O design modular flexível permite a operação de coluna monolítica com opções de configuração isocrática ou gradiente.
Polimento de mRNA
O polimento pode ser usado para direcionar as impurezas remanescentes - incluindo proteínas, dsRNA e RNAs truncados - remanescentes após a captura de mRNA. Em um campo de rápida evolução como a terapêutica de mRNA, você precisa de ferramentas abrangentes para remover todos os tipos de material contaminante, garantindo que sua molécula atenda aos requisitos de qualidade necessários para aplicações clínicas.
Soluções flexíveis e escaláveis que permitem a remoção de contaminantes residuais em alta resolução
- Alta capacidade de ligação para mRNA
- Capacidade de discriminar até mesmo moléculas altamente semelhantes (como a separação de mRNA de dsRNA)
A Sartorius oferece soluções de polimento de mRNA por meio de nossa gama de tecnologias monolíticasge of monolithic technologies
- Remoção flexível e direcionada de impurezas residuais por troca aniônica, fase reversa ou interações hidrofóbicas
- Evita a necessidade de altas temperaturas e solventes orgânicos, que podem ser um gargalo de fabricação
- Alta capacidade de ligação dinâmica para mRNA e procedimentos de baixo cisalhamento para maximizar o rendimento
- Resolução superior com alargamento mínimo de pico
Explore ferramientas mRNA Consulte nossos especialistas
O Asistema de cromatografia single-use Allegro foi projetado para produção piloto, clínica e comercial. O design modular flexível permite a operação de coluna monolítica com opções de configuração isocrática ou gradiente.
Concentração, Diafiltração e Filtração Estéril
As etapas de concentração e diafiltração reduzem o volume da amostra e removem pequenas moléculas do tampão. Isso pode ser realizado em vários estágios ao longo do procedimento. Durante as etapas finais, o mRNA purificado é submetido a filtração estéril.
Métodos de filtração suaves compatíveis com a sensibilidade do mRNA à degradação e tensão de cisalhamento
- Recuperação máxima de mRNA apesar de sua instabilidade
- Mitigar o risco de introdução de novos contaminantes, como RNase, no produto final
A Sartorius oferece soluções de purificação intuitivas e fáceis de usar para concentração e diafiltração de mRNA com recursos que incluem um formato de cassete com radiação gama. Hydrosart® é uma membrana de fluxo cruzado de última geração projetada para baixa adsorção de mRNA e garante compatibilidade com qualquer aplicação.
- Membranas com pontos de corte de peso molecular de 2 kD a 300 kD disponíveis
- Fornece baixa adsorção, alta taxa de fluxo e maior recuperação do produto
- Resistente a produtos químicos, vapor, calor e irradiação gama, e pode ser usado com até 40% de concentração de etanol, permitindo uma ampla gama de condições operacionais com baixa incrustação
- Sartocon® Self Contained Units (0.1m² to 14m²) podem ser entregues esterilizadas por gama, facilitando o processamento fechado, escalonável e pronto para uso
- Sartopore® oferece a mais ampla gama de combinações de membranas PES, adaptando-se perfeitamente a todos os tipos de produtos com os menores custos de filtração. Disponível com tamanhos de poro de 0,2 ou 0,45 µm, essas membranas permitem a filtração estéril com uma alta taxa de retenção. Conjuntos de transferência pré-projetados e configuráveis são fornecidos com radiação gama.
- Uma ampla gama de sistemas de fluxo cruzado cobre necessidades de desenvolvimento de processos para produção comercial em larga escala, com a opção de implementar soluções funcionalmente fechadas com caminhos de fluxo de uso único e irradiados por gama
Armazenamento e transporte de substâncias medicamentosas
Bioterapêuticos são produtos valiosos e frequentemente sensíveis que requerem um manuseio cuidadoso durante a produção, armazenamento e movimentação para outras instalações. O projeto detalhado dos métodos de armazenamento e transporte de substâncias medicamentosas é essencial para proteger a integridade do produto e garantir a segurança do paciente. Muitos medicamentos, incluindo mRNA terapêuticos, são armazenados em estado congelado para desacelerar a degradação química e biológica, estender a vida útil do produto, restringir o crescimento microbiano e evitar agitação excessiva por cisalhamento.
Soluções congeladas de armazenamento e transporte que protegem moléculas de mRNA sensíveis
- Soluções robustas e confiáveis para limitar as flutuações ambientais e preservar o produto
- Sistemas seguros, protegidos e rastreáveis para rastrear o mRNA ao longo de sua jornada
- Efeitos limitados da crioconcentração
Nossa linha Celsius® inclui produtos descartáveis, com radiação gama e prontos para uso para garantir a preservação e transferência segura e simples de material biológico congelado.
Celsius® CFT – nossa plataforma de congelamento / descongelamento totalmente integrada
- Robusta, escalável, reproduzível e fácil de usar tecnologia de congelador de placa controlada vertical com um histórico estabelecido
- Congelamento e descongelamento rápido e controlado e rápido com agitação para mitigar o efeito de crioconcentração observado para processos de congelamento e descongelamento em grande escala
- Alta capacidade (até 100 L)
Celsius® S3 – um sistema de bancada totalmente escalonável para produção comercial.
- Mesmo comprimento de freezepath e tecnologia de troca de calor como soluções em larga escala, o que significa que os protocolos de congelamento / descongelamento são transferíveis
Celsius® FFTp - pré-montado e pronto para encher contêineres de uso único para aproveitar a infraestrutura existente..
- Alta robustez garantida por nossa tecnologia inovadora SafecoreTM, Celsius® FFT/FFTp são totalmente qualificados até -80 ° C contra o pior caso de envio de condições
- O Celsius® FFT pode ser usado com qualquer freezer convencional e o Celsius® FFTp projetado explicitamente para congeladores de placas
Nanopartículas lipídicas (LNPs) encapsulam o mRNA, protegendo-o da degradação e promovendo sua entrega nas células-alvo. Lipídios e etanol são usados na reação química, durante a qual o mRNA é capturado no LNP. O tamanho do LNP difere com base no protocolo da empresa, variando de cerca de 5 a 100 nm. Após uma etapa de polimento opcional, o mRNA encapsulado está pronto para a filtração final e o mRNA livre é removido por concentração e diafiltração.
Caixa de ferramentas mRNA
Simplifique Seu Processo de Produção de mRNA
A produção de mRNA ainda não é uma abordagem de plataforma. O mRNA contém uma estrutura de fosfato carregada e resíduos de nucleotídeos hidrofóbicos com capacidade de ligação de hidrogênio; seu rico espectro de propriedades químicas é a base para uma seleção diversificada de colunas de purificação. Nossa caixa de ferramentas de soluções permite que você crie um processo de produção de mRNA que melhor se adapte à sua aplicação:
- Múltiplas opções de purificação disponíveis
- Abordagem plug-and-play simples
- Não requer otimização significativa
- Suporte técnico especializado disponível
Explore Monoliths
A separação superior do mRNA da mistura IVT significa que suas amostras estão livres de contaminantes
Especialistas em produção e purificação de pDNA e mRNA, desde a produção linearizada de pDNA e reações IVT até mRNA purificado
Nossa caixa de ferramentas é compatível com diversas atividades de bioprocessamento e permite a purificação de um amplo espectro de moléculas de mRNA
Colunas monolíticas para purificação confiável de mRNA
Aproveite o poder dos monólitos para isolamento de alta resolução de moléculas de mRNA.
Nossa linha de colunas monolíticas é alimentada por químicas distintas, mas complementares, para se adequar a qualquer aplicação. Descubra a combinação que funciona melhor para o seu processo de produção de mRNA.
CIMmultus® Oligo dT
Cromatografia de afinidade de hibridização
CIMmultus® Oligo dTpermite uma captura de afinidade em uma única etapa de mRNA poliadenilado. A ligação ocorre através de ligações de hidrogênio, com o Oligo dT formando uma associação híbrida estável com a sequência poli (A) terminal do mRNA alvo. A coluna está disponível com linkers C6 e C12.
- Abordagem conveniente para purificação inicial de mRNA
- Contaminantes não RNA fluem através da coluna durante o carregamento da amostra, removendo proteínas e DNA de forma eficiente
- Captura todas as espécies de RNA, independentemente do tamanho ou encalhe
- Projetado principalmente para captura de mRNA, mas também pode ser usado durante o polimento
Como funciona?
Cromatograma da mistura de IVT aplicada ao CIMmultus® Oligo dT. O mRNA (linha azul-petróleo, pico em torno de 16 min) e contaminantes não-RNA (linha azul-petróleo, pico em torno de 2 min) são mostrados em uma captura de afinidade de etapa única, durante a qual a coluna é lavada e o mRNA é recuperado. A linha tracejada mostra a condutividade.
Troca de ânions
CIMmultus® PrimaS
Cromatografia de troca aniônica com ligação de hidrogênio
PrimaS é um ligante de cromatografia multimodal que combina elementos de ligação de hidrogênio com cromatografia de troca aniônica. CIMmultus® PrimaS suporta a purificação de RNA de fita simples em temperatura ambiente.
- Captura todos os RNAs, independentemente de sua estrutura ou composição
- Purifica e seleciona o tamanho de mRNA de fita simples grande (ssRNA)
- DNA e proteínas eluem antes - e estão bem separados de - ssRNA
- Útil para construções não poliadeniladas
- Pode ser usado como método de captura de alta resolução ou para polimento
Como funciona?
Cromatograma da mistura de IVT aplicada ao CIMmultus® PrimaS. A linha verde-azulada mostra que o DNA superenrolado (scDNA, 6 kb) está separado do ssRNA (5 kb) em um gradiente de pH (linha tracejada).
Interação Hidrofóbica
CIMmultus® C4 HLD
Cromatografia de interação hidrofóbica
C4 (butil) Alta Densidade de Ligante (HLD) é fortemente hidrofóbica. A amostra é aplicada em alta força iônica em sais que precipitam RNA, e o RNA é eluído com um gradiente de sal decrescente.
- Altamente eficaz para remover proteínas de ácidos nucleicos (pDNA, RNA)
- Melhores resultados como ferramenta de polimento
- Separa ssRNA de DNA, dsRNA e RNA truncado
- Liga fortemente as proteínas, removendo-as da amostra
- Proteínas normalmente eluídas pela etapa de limpeza de NaOH
Como funciona?
Cromatograma da mistura de IVT aplicada ao CIMmultus® C4 HLD. ssRNA (linha azul-petróleo, pico em torno de 8 min.) e contaminantes (linha azul-petróleo, pico em torno de 1 minuto) são mostrados durante o polimento, onde as concentrações de sal (linha tracejada) são moderadas para enriquecer o ssRNA.
Fase reversa
CIMmultus® SDVB
Cromatografia de Fase Reversa
CIMmultus® SDVB usa cromatografia de fase reversa baseada em estireno-divinilbenzeno (SDVB) para separar ssRNA de formas truncadas, dsRNA e DNA. Sua seletividade para separação de espécies de fita simples e dupla de tamanho semelhante é influenciada pelo grau de emparelhamento de bases.
- Mais adequado como método de polimento
- Também realiza separação de tamanho
- Ferramenta de escolha para caracterizar dsRNA e discriminar ssRNA intacto de transcrições curtas
Como funciona?
Cromatograma de escadas de RNA (desnaturado a 65 ° C) aplicado a CIMmultus® SDVB. A linha azul-petróleo mostra a separação do tamanho do ssRNA durante a eluição. A linha preta mostra dsRNA.
