DNA de plasmídeo (pDNA)
Plasmid DNA (pDNA) represents a critical starting point for many genetic engineering pursuits, including the development of recombinant proteins, viral vectors, and advanced biotherapeutics. Continued progress in gene therapy and DNA/baseada em DNA/RNA-based therapeutics levou a uma demanda crescente por processos de produção de pDNA confiáveis adequados para aplicações clínicas.
Os plasmídeos são moléculas circulares de DNA encontradas naturalmente em bactérias. Eles se replicam de forma independente (epissomal) do DNA genômico bacteriano, uma propriedade que os torna idealmente adequados como um vetor para engenharia genética. O pDNA purificado pode ser usado como matéria-prima em processos como a produção de vetores adeno-associados (AAV) e lentivirais, reações de transcrição in vitro (IVT) durante a produção de mRNA e transferência direta de genes.
A Sartorius fornece várias ferramentas para fabricação eficiente em toda a produção de pDNA. Explore o processo de fabricação de DNA de plasmídeo desde bactérias até a filtração final abaixo e descubra as soluções que o orientam em cada etapa.
Recuperar altos rendimentos de pDNA pode ser complicado devido ao seu tamanho, sensibilidade ao cisalhamento e semelhança com alguns contaminantes.
- As culturas de células de alta densidade costumam ser difíceis de monitorar, manter e colher.
- As forças de cisalhamento podem danificar o pDNA e degradar o DNA genômico precipitado, contaminando o extrato do plasmídeo.
- Plasmídeos grandes (> 6kb) são difíceis de purificar usando métodos tradicionais, como resinas, uma vez que eles não podem se difundir com sucesso através dos poros.
- A separação de pDNA de contaminantes (incluindo isoformas de plasmídeo indesejadas) para obter um produto homogêneo pode ser tecnicamente exigente, muitas vezes exigindo várias etapas de cromatografia.
Processo de produção de pDNA
De E. coli para Plasmídeo Purificado
O gene de interesse é inserido no pDNA, que é introduzido na bactéria hospedeira (tipicamente E. coli) em um processo denominado transformação, geralmente por eletroporação. As células hospedeiras se replicam durante a fermentação, fazendo cópias do plasmídeo e produzindo altos rendimentos da sequência desejada. Assim que as células atingem a densidade desejada, elas são colhidas e o pDNA é extraído, normalmente por lise alcalina. O lisado é então clarificado e o pDNA é purificado por cromatografia. Finalmente, o plasmídeo é então concentrado e filtrado antes de ser submetido a medidas de controle de qualidade para garantir que o produto seja de pureza suficiente.
pDNA Process Flow
As bactérias hospedeiras são expandidas para produzir milhões de cópias do pDNA
O objetivo do processamento a montante na produção de plasmídeo é gerar o máximo de pDNA possível usando uma população de células hospedeiras. Normalmente, as E. coli são utilizadas devido à sua capacidade de proliferar e produzir rapidamente elevados rendimentos de pDNA. Um clone de alta produção é selecionado e usado para formar o trem de sementes, que fornece números de células adequados para inocular o biorreator de produção. Após o cultivo, as células são colhidas, geralmente por centrifugação.
Bactérias hospedeiras são expandidas para produzir milhões de cópias d...
Uma plataforma de produção escalonável para otimizar o crescimento celular e maximizar o rendimento do plasmídeo de uma maneira simples e confiável
- Produção robusta, controlável e eficiente
- Um trem de sementes estéreis para evitar contaminação cruzada
- Bombas de alimentação de alta velocidade
A Sartorius oferece uma variedade de soluções para fermentação microbiana em todas as escalas de produção.
Biostat® D-DCU é um sistema de bioprocesso compacto com tamanhos de recipientes de 10 a 200 L, atendendo aos requisitos para fermentação de alta densidade de E. coli (> 50 OD).
- Um filme único e robusto em todo o processo para otimizar as condições de crescimento celular
- Integração de uma ampla gama de tecnologia analítica de processo (PAT), incluindo BioPAT Trace e
- Flexibilidade e escalabilidade total de Ambr® para reator de tanque agitado (STR) para desenvolvimento de processo rápido
- Mycap CCX – - um sistema de expansão de cultura de células que permite que você cresça e passe células sem nunca abrir um frasco ou entrar em um gabinete de biossegurança
- Biorreatores multiparalelos single-use Ambr® 250 que podem ser adaptados para fermentação microbiana para acelerar o desenvolvimento do processo.
- Cartuchos de fibra oca single-use dentro de nossa Green Line suportam a coleta de células de culturas de alta densidade.
As células hospedeiras são lisadas para liberar o pDNA
O objetivo da lise celular é liberar pDNA e remover restos celulares e DNA genômico. Uma vez que as células hospedeiras são colhidas, o pellet celular é lisado com solução de NaOH e subsequentemente neutralizado com acetato de potássio. O precipitado resultante contém impurezas, incluindo proteínas da célula hospedeira e DNA.
Remoção inicial de restos celulares de pDNA
O material coletado da lise alcalina contém pDNA, bem como contaminantes das células hospedeiras. A clarificação purifica o pDNA de culturas de células de alta densidade, removendo resíduos celulares e impurezas.
Soluções de clarificação de pDNA ideais que separam as impurezas até mesmo dos lisados de células de maior densidade
- As ferramentas devem ser capazes de lidar com soluções altamente viscosas
A Sartorius fornece uma ampla gama de consumíveis de filtração de fluxo tangencial (TFF), cobrindo aplicações desde o desenvolvimento de processos até a produção comercial em grande escala. Nossos módulos de fibra oca Green Line oferecem uma plataforma totalmente escalonável para o esclarecimento de lisados celulares, especialmente em ambientes de alta densidade celular. As membranas de microfiltro Hydrosart® 0.2µm Microfilter membranes são recomendadas para concentrações de células médias ou baixas.
- Membrana oferecendo de corte de peso molecular de 3 kD a 750 kD e tamanho de poro de 0,1 μm a 0,65 μm Com radiação gama; Uso único e pronto para usar, economizando tempo e custos associados à configuração do equipamento Particularmente eficaz para lisados viscosos de culturas de alta densidade celular
- A família Sartopore® 2 family oferece a mais ampla gama de combinações de membranas PES que se adaptam perfeitamente a todos os tipos de produtos com os menores custos de filtração.
- A Sartorius fornece uma ampla gama de sistemas TFF, cobrindo aplicações desde o desenvolvimento de processos até a produção comercial em grande escala. Nossas soluções têm a opção de implementar soluções funcionalmente fechadas com caminhos de fluxo de uso único e com radiação gama.
O volume da amostra é reduzido e pequenas moléculas são removidas do tampão.
A concentração de pDNA, remoção de contaminantes e etapas de troca de tampão são essenciais na produção de pDNA, mas podem ser desafiadores devido ao grande tamanho e sensibilidade ao cisalhamento do pDNA. As inovações mais recentes combinam operações de baixo cisalhamento e processamento totalmente fechado para permitir a mais alta recuperação em um sistema contido, criando um ambiente ideal para a fabricação de pDNA.
Soluções de concentração personalizadas para moléculas grandes e sensíveis
- Corte limitado para minimizar a degradação e má recuperação
- Recuperação máxima mesmo das maiores construções
A Sartorius oferece um forte portfólio de produtos adequados para a concentração / diafiltração de biomoléculas. Nossos conjuntos de fluxo de fibra oca de uso único Green Line representam um sistema totalmente escalonável para concentração de pDNA
- Gama de tamanhos para suportar a filtração de plasmídeos grandes (até 750 kb). A pesquisa recomenda entre 30 kD e 750 kD MWCO.
- Com radiação gama e pronto para usar, reduzindo os tempos de processo
- Operações de baixo cisalhamento
- A família Sartopore® 2 inclui a mais ampla gama de combinações de membranas PES que se adaptam perfeitamente a todos os tipos de produtos com os menores custos de filtração
Isolamento de DNA de plasmídeo
Como um produto biofarmacêutico, o pDNA está sujeito a requisitos rigorosos de pureza, eficácia e rendimentos. A captura de pDNA é uma etapa crítica no processo de downstream, removendo a maioria dos contaminantes enquanto concentra o pDNA.
Processos de captura de pDNA que são sensíveis, de baixo cisalhamento e adequados para moléculas grandes.
- Remoção eficiente e suave de impurezas para evitar a degradação
- Métodos de captura sem restrições de tamanho
O HIP² Plasmid Process Pack™ é uma solução ponta a ponta para purificação de pDNA desenvolvida por cientistas especialistas da Sartorius.
As colunas CIMmultus® DEAE representam a primeira etapa de nossa plataforma plug and play para purificação eficaz de pDNA
- Concentra o pDNA e remove a maioria das proteínas da célula hospedeira e outros ácidos nucléicos.
- Alta capacidade de ligação dinâmica para pDNA
- Baixas forças de cisalhamento maximizam a recuperação de pDNA
- Nosso protocolo detalhado e direto apóia o desenvolvimento de um processo robusto
- O sistema de cromatografia single-use Allegrofoi projetado para produção piloto, clínica e comercial. O design modular flexível permite a operação de coluna e membrana com opções de configuração isocrática ou gradiente
Separação de isoformas de plasmídeo para produzir pDNA homogêneo
Uma etapa adicional de cromatografia de polimento é necessária para separar as isoformas de pDNA, geralmente para isolar o pDNA superenrolado (SC) do DNA circular aberto (OC) e linear. O pDNA farmacêutico tem requisitos rigorosos de pureza, homogeneidade e eficácia, e o pDNA SC é a forma mais estável, eficiente e biologicamente ativa
Soluções de cromatografia de polimento eficientes e robustas que produzem extratos de pDNA homogêneos de forma confiável
- Os métodos devem ser sensíveis o suficiente para separar isoformas de plasmídeo
The HIP² Plasmid Process Pack™ da Sartorius é uma solução abrangente de purificação de pDNA.
As colunas CIMmultus® C4 HLD formam a segunda etapa do HIP² Plasmid Process Pack™
- Separa isoformas de pDNA circulares abertas (OC) e lineares de pDNA superenrolado (SC)
- Alta capacidade de ligação dinâmica e baixo cisalhamento maximizam a recuperação de pDNA
- Oferece flexibilidade e escalabilidade
- O sistema de cromatografia single-use Allegro foi projetado para produção piloto, clínica e comercial. O design modular flexível permite a operação de coluna e membrana com opções de configuração isocrática ou gradiente
O volume da amostra é reduzido e pequenas moléculas são removidas do tampão.
A concentração de pDNA, remoção de contaminantes e etapas de troca de tampão são essenciais na produção de pDNA, mas podem ser desafiadores devido ao grande tamanho e sensibilidade ao cisalhamento do pDNA. As inovações mais recentes combinam operações de baixo cisalhamento e processamento totalmente fechado para permitir a mais alta recuperação em um sistema contido, criando um ambiente ideal para a fabricação de pDNA.
Soluções de concentração personalizadas para moléculas grandes e sensíveis
- Corte limitado para minimizar a degradação e má recuperação
- Recuperação máxima mesmo das maiores construções
A Sartorius oferece um forte portfólio de produtos adequados para a concentração / diafiltração de biomoléculas. Nossos conjuntos de fluxo de fibra oca de uso único Green Line representam um sistema totalmente escalonável para concentração de pDNA
- Gama de tamanhos para suportar a filtração de plasmídeos grandes (até 750 kb). A pesquisa recomenda entre 30 kD e 750 kD MWCO.
- Com radiação gama e pronto para usar, reduzindo os tempos de processo
- Operações de baixo cisalhamento
- A família Sartopore® 2 inclui a mais ampla gama de combinações de membranas PES que se adaptam perfeitamente a todos os tipos de produtos com os menores custos de filtração
O pDNA isolado está sujeito a filtração estéril para evitar contaminação microbiana
A etapa final de filtração estéril é crítica para prevenir a contaminação microbiana e garantir a segurança do paciente. Estratégias inovadoras de mitigação de risco protegerão a integridade de toda a operação, desde a última etapa de filtração até o armazenamento em sacos descartáveis.
Soluções de filtração estéreis aplicáveis a grandes moléculas de pDNA sensíveis ao cisalhamento
- Adequado para soluções viscosas
A Sartorius oferece os filtros estéreis mais avançados para sua aplicação. A família Sartopore® 2 inclui a mais ampla gama de combinações de membranas PES que se adaptam perfeitamente a todos os tipos de produtos com os menores custos de filtração
- Disponível com tamanho de poro de membrana final de 0,2 ou 0,45 µm
- Integrado no conjunto de transferência de filtro para aplicativos fechados de uso único
- Sartopore® Platinum é a escolha ideal para aplicações de enchimento final. A modificação de superfície exclusiva da membrana PES fornece a menor adsorção, facilitando o alto rendimento do produto e umedecimento seguro para testes de integridade confiáveis.
- Sartocheck 5 é a referência para testes de integridade de filtros de grau de esterilização. A unidade é projetada para fornecer integridade e segurança de dados intuitiva e líder do setor com os mais altos padrões de gerenciamento de risco quantitativo (QRM) para teste
As análises são necessárias para determinar a presença de impurezas e quantificar o produto ao longo do processo de purificação do pDNA. As informações fornecidas apoiam o controle do processo, robustez e alta qualidade do produto.
Uma solução analítica que fornece uma avaliação abrangente da amostra de pDNA
- Forneça rapidamente uma imagem completa do produto final
- Evite métodos de trabalho intensivo
A Sartorius oferece soluções completas para monitorar e controlar suas amostras de pDNA.
Nossas CIMac™ pDNA 0.3 mL Analytical Columns destinam-se ao monitoramento e quantificação por HPLC rápida e reproduzível de DNA de plasmídeo, bem como à separação de diferentes isoformas de DNA de plasmídeo.
- Projetado principalmente para o controle em processo e final de amostras de pDNA em vários estágios do processo de purificação,
- Também pode ser usado para determinar a presença de RNA e endotoxinas
- Análise rápida de alta resolução
- Separação independente de fluxo
- Alta sensibilidade e reprodutibilidade
- O sistema PATfix™ HPLC oferece uma análise "at-line" para o controle de impurezas e componentes críticos de qualidade usando impressão digital HPLC
CIMmultus® HiP2 Plasmid Process Pack™
CIMmultus® HiP2 Plasmid Process Pack™
Criamos um pacote de purificação de pDNA pronto para usar para ajudar os cientistas a desenvolver seu próprio processo de purificação de pDNA e transferi-lo para a produção. A plataforma HiP2 facilita a recuperação eficiente de pDNA em apenas duas etapas de cromatografia (cromatografia de troca aniônica seguida de cromatografia de interação hidrofóbica).
- Eficiente - remove a maioria dos contaminantes (RNA, DNA genômico, proteínas da célula hospedeira e endotoxinas) e isola o pDNA superenrolado
- Rápido - o processamento é concluído em apenas algumas horas, aumentando a produtividade e minimizando os custos de fabricação. Um protocolo bem definido ajuda a desenvolver procedimentos de purificação robustos rapidamente.
- Escalável - as propriedades exclusivas das colunas monolíticas facilitam a transferência contínua entre os níveis de produção, desde o laboratório de pequena escala até a purificação industrial de pDNA em grande escala.
Saiba mais sobre como os monólitos realizam cromatografia de polimento durante a purificação de pDNA
A excelente remoção de todas as impurezas produz amostras de pDNA homogêneas e de alta pureza, incluindo a separação isoforma
Realize um processamento rápido sem comprometer a recuperação e a capacidade, mesmo para plasmídeos grandes
A caixa de ferramentas contém duas colunas prontas para uso e um protocolo detalhado para incorporação rápida e fácil em seu processo
Products in the CIMmultus® HiP2 Plasmid Process Pack™
CIMmultus® DEAE
Cromatografia de troca aniônica
Usando cromatografia de troca aniônica fraca, CIMmultus® dietilamina (DEAE) concentra o pDNA e remove a maioria das proteínas da célula hospedeira contaminantes, mRNA e DNA genômico.
Executa a captura inicial no pacote de processo de plasmídeo de duas etapas
Pode ser usado para processar lisados clarificados ou plasmídeos parcialmente purificados de outros métodos de purificação
Alta capacidade de moléculas de pDNA, que se concentram em um único pico
A maioria das impurezas não se ligam (com exceção do RNA, que elui após o primeiro aumento de NaCl)
O tamanho do pDNA não é um fator limitante
Para pDNA maior que 11 kb, recomendamos 6 canais μm
Como funciona?
Cromatograma do extrato de pDNA aplicado ao CIMmultus® DEAE. O pDNA é isolado de forma eficiente do RNA e de outros contaminantes.
Interação Hidrofóbica
CIMmultus® C4 HLD
Cromatografia de interação hidrofóbica
A coluna monolítica modificada com butil CIMmultus® C4 de alta densidade de ligante (HLD) elimina o DNA genômico remanescente, endotoxinas e isoformas de pDNA circular aberto (OC) e linear, isolando pDNA superenrolado (SC).
Executa a etapa de polimento no pacote de processo de plasmídeo de duas etapas
Ligação de pDNA promovida sob altas concentrações de sal
O restante dos contaminantes não DNA são removidos
Facilita a separação de pDNA superenrolado de outras isoformas
A purificação de pDNA pode ser realizada em ambos os modos de eluição de ligação e de deslocamento de amostra
Como funciona?
Cromatograma de pDNA capturado aplicado a CIMmultus® C4 HLD. Os restantes contaminantes são removidos e o pDNA de SC é eficazmente isolado de pDNA de OC.
Recursos
In-Process Control of pDNA Production on CIMac™ pDNA Analytical Column
PDF | 463,7 KB
Comparison of HIC Monolithic Support for Sample Displacement Chromatography of pDNA
PDF | 468,2 KB
