Contaminantes microbiológicos
Satisfacer sus necesidades de pruebas de microbiología
Durante la producción de biofármacos, los microorganismos contaminantes pueden ingresar al proceso en muchas etapas. Una vez introducidos, las bacterias y los hongos pueden replicarse exponencialmente, comprometiendo gravemente el producto final. Además, el uso de líneas de células de mamíferos para la producción introduce el potencial de contaminación por micoplasmas y micobacterias.
La presencia de microorganismos en vacunas y otros biofármacos puede, con el tiempo, afectar al producto y representar un riesgo importante para la salud del paciente. Como tal, los organismos reguladores, incluida la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. (FDA) y la Agencia Europea de Medicamentos (EMA), cuentan con pruebas estrictas para garantizar que no se haya producido contaminación. Esto se determina mediante pruebas microbiológicas de muestras representativas de un lote para identificar la presencia de microorganismos viables en el material. La prueba de que su producto está libre de contaminantes microbianos es parte de la documentación requerida para la liberación de productos biofarmacéuticos.
Sartorius proporciona un paquete completo de ensayos de bioseguridad en microbiología para cubrir sus requisitos de pruebas de contaminación microbiológica que incluyen:
- Esterilidad por inoculación directa
- Recuento microbiano de productos no estériles por método de placa
- Ensayo de cultivo de micoplasma
- Mycoplasma por PCR
- Detección de Mycobacterium spp.
Detección de endotoxinas usando Pyros® Kinetix® Flex
Nuestros expertos diseñan un plan de pruebas de microbiología en torno a sus necesidades únicas de desarrollo de fármacos o productos comerciales.
Los métodos de prueba microbianos listos para usar y de calidad garantizada, con calificación o validación de la matriz de su producto en el ensayo, reducen los plazos de prueba.
Los métodos basados en PCR aceleran la fabricación; Las pruebas compendiales se llevan a cabo en paralelo para satisfacer sus necesidades de desarrollo de fármacos o liberación de lotes comerciales.
Cree su estrategia de pruebas de microbiología
| Muestra de | Prueba de esterilidad | Prueba de enumeración microbiana | Prueba de micoplasma (compendio) | Prueba de micoplasma por PCR | Pruebas de micobacterias | Prueba de endotoxinas |
|---|---|---|---|---|---|---|
Banco de células de investigación | X | - | - | X | X* | - |
Banco de células maestras | X | - | X | - | X* | - |
Banco de células de trabajo | X | - | X | - | X* | - |
Banco de células de fin de producción | X | - | X | - | X* | - |
Reservas de semillas de virus maestros | X | - | X | (X) | X* | - |
Stocks de semillas de virus de trabajo | X | - | X | (X) | X* | - |
Cosecha a granel no purificada | - | X | X | (X) | X* | - |
| Substancia de droga | X | - | - | - | - | - |
| Producto de droga | X | - | - | - | - | X |
X * Las pruebas de micobacterias solo se requieren para líneas celulares de humanos o primates y productos derivados de líneas celulares de humanos o primates.
(X) Pueden emplearse otros enfoques basados en el riesgo para las pruebas de micoplasma cuando no se pueda neutralizar el virus de la muestra. Esto debe discutirse con su regulador.
Sterility Testing
Las pruebas de esterilidad deben realizarse y demostrarse durante todo el proceso de producción de una vacuna biológica o viral.
Sartorius ofrece pruebas de esterilidad por inoculación directa y por filtración por membrana según las normas GMP y de conformidad con las normas de la Farmacopea Europea (EP), la Farmacopea Japonesa (JP) y la Farmacopea de los Estados Unidos (USP).
Antes de la prueba, la matriz de la muestra debe calificarse en el ensayo para examinar cualquier efecto inhibidor; esto se logra agregando el material de prueba con organismos de prueba representativos a bajas concentraciones y observando un crecimiento aceptable.
Los siguientes organismos son adecuados como organismos modelo:
Bacterias aerobias
- Staphylococcus aureus
- Bacillus subtilis
- Pseudomonas aeruginosa
Bacteria anaeróbica
- Clostridium sporogenes
Hongos
- Candida albicans
- Aspergillus brasiliensis
En la prueba de esterilidad directa, la muestra se inocula en dos medios de crecimiento diferentes: tioglicolato líquido y digestión de caseína de soja. Para la prueba de filtración por membrana, la muestra se filtra a través de filtros de 0,45 µM que luego se inoculan en caldo de soja Trypticase (TSB) y medio de tioglicolato fluido. En ambos métodos, la prueba se incuba durante 14 días. Sartorius puede informar los resultados del ensayo con un certificado de análisis dentro de los 5 días posteriores a las observaciones finales.
Cabe señalar que estas pruebas de esterilidad no son aplicables a artículos que no están destinados a ser estériles; En este caso, debe utilizarse una prueba de carga biológica.
Sartorius puede asesorarle sobre las pruebas adecuadas para su material, así como sobre el número de muestras y los volúmenes.
Enumeración microbiana
El propósito de una prueba de carga biológica es enumerar las bacterias y hongos mesófilos que pueden crecer en condiciones aeróbicas. La prueba está diseñada principalmente para determinar si una sustancia o preparación cumple o no con una especificación establecida para la calidad microbiológica. Es similar a la prueba de esterilidad, pero se realiza donde no se requiere que la muestra sea estéril, ya que se someterá a un procesamiento adicional. Por lo tanto, esta prueba se usa generalmente para materias primas y muestras en proceso, como cosechas a granel, donde el cliente ha establecido límites aceptables de carga biológica para sus procesos internos. (Las pruebas de esterilidad también se pueden realizar en muestras recolectadas a granel que se espera que sean estériles. El desarrollador decide si utilizar una prueba de carga biológica o de esterilidad).
Hay dos métodos disponibles para la prueba de carga biológica: filtración por placa o por membrana. Ambos son aceptables para los reguladores y pueden usarse a discreción del desarrollador. El método de placa es más típico para procesar un gran volumen de muestra. Si se observan ciertos efectos inhibidores, como los de los antibióticos, entonces se puede usar la filtración por membrana.
En el método de recuento en placa, el material de prueba se diluye 10 veces en agua tamponada antes de esparcir volúmenes predefinidos en 2 placas TSA y 2 placas SDA. Estos se incuban y se registra el promedio de UFC / mL.
Sartorius puede asesorarle sobre las pruebas y los métodos de prueba adecuados para su material.
Prueba de micoplasma
La detección y eliminación de micoplasmas es fundamental para los productos biológicos producidos para estudios clínicos y productos autorizados para uso humano. La prueba es complicada, ya que la familia de microbios tiene muchos requisitos de crecimiento diferentes y, a menudo, exigentes. Sartorius ofrece servicios de análisis de micoplasmas que cumplen con los estándares cGMP y con las directrices actuales del Consejo Internacional para la Armonización de Requisitos Técnicos para Productos Farmacéuticos de Uso Humano (ICH), la Farmacopea Europea (EP) y la Farmacopea de los Estados Unidos (USP).
Hay dos componentes tradicionales de las pruebas de micoplasma descritos en el PE: el método de agar y caldo y el método de cultivo de células indicadoras in vitro. La matriz de la muestra que se va a analizar debe estar calificada en el ensayo antes de realizar la prueba; La calificación implica agregar al material de prueba organismos de prueba a concentraciones bajas y demostrar la detección.
Los siguientes organismos son adecuados como organismos de prueba:
- A. laidlawii
- M. gallisepticum
- M. fermentans
- M. hyorhinis
- M. orale
- M. pneumoniae.
Agar y caldo
Para el método de agar y caldo, la muestra se inocula en diferentes tipos de medios líquidos y sólidos, que posteriormente se incuban en diferentes condiciones ambientales (aeróbicas y anaeróbicas). Durante el período de incubación, también se toman muestras del caldo inoculado y se inoculan en el medio de cultivo de agar. La detección de colonias indica una prueba positiva; toda la prueba dura 28 días.
Cultivo celular indicador in vitro
El método de cultivo de células indicadoras in vitro requiere que la muestra sea inoculada en un sustrato celular adecuado (células de ratón 3T3 o células Vero), cultivada y teñida con un tinte fluorescente que se une al ADN. Los cultivos se observan mediante microscopía óptica para identificar manchas fluorescentes, o gránulos, que rodean el núcleo de las células indicadoras, lo que indica la presencia de micoplasmas. Sartorius puede informar los resultados del ensayo con un certificado de análisis dentro de los 5 días posteriores a las observaciones finales.
Reacción rápida en cadena de la polimerasa de micoplasma (PCR)
Además de los métodos de agar y caldo, la Farmacopea Europea ahora acepta una prueba de micoplasma basada en PCR, después de la validación adecuada. El EP se une a la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. (FDA), que ha aceptado el uso de la detección de micoplasmas basada en PCR para la liberación de un producto biofarmacéutico desde 2012. Con esta prueba, los fabricantes pueden reemplazar los métodos existentes, que pueden durar hasta 28 días, con una técnica rápida. La prueba de PCR de Mycoplasma se puede realizar en Sartorius y se informa del resultado en 48 horas desde la recepción de la muestra.
Pruebas de micobacterias
Este ensayo se realiza cuando se analizan líneas celulares humanas o de primates, que son susceptibles a Mycobacterium spp.
La muestra se inocula en dos tipos de medio de agar selectivo y un tipo de medio de caldo. El medio se cultiva durante 56 días a una temperatura de 36 a 38 ° C y se observa la presencia de micobacterias.
Para calificar la prueba, se incluye un control enriquecido, donde el material de prueba se desafía con el control positivo Mycobacterium tuberculosis para probar la inhibición del crecimiento de micobacterias.
Este método cumple con la sección 2.6.2 de la Farmacopea Europea.
Prueba de endotoxinas
Las pruebas de endotoxinas generalmente se realizan solo en el producto final del fármaco. Las endotoxinas forman parte de la membrana externa de la pared celular de las bacterias gramnegativas, que pueden potencialmente contaminar los cultivos celulares durante la producción de productos biofarmacéuticos o contaminar los productos terapéuticos finales.
La prueba turbidimétrica se realiza agregando lisado de amebocitos de limulus (LAL), un extracto acuoso de células sanguíneas (amebocitos) del cangrejo herradura del Atlántico, a la muestra líquida o dilución estándar de endotoxina. Luego se mide la turbidez de la mezcla de reacción. A concentraciones más altas de endotoxinas, la enzima de coagulación se activa más rápidamente, por lo que la muestra se vuelve más turbia. Como ensayo cinético, el tiempo que tarda cada muestra en alcanzar una densidad óptica (DO) particular es la medida crítica.
El software Pyros® Kinetix® Flex y Pyros® eXpress han sido validados para realizar análisis cinéticos turbidimétricos. Los tiempos de inicio de la muestra se comparan con una curva estándar para cuantificar la concentración de endotoxina de la muestra.
El ensayo cinético de endotoxinas realizado en Sartorius sigue las endotoxinas bacterianas USP <85> armonizadas y las endotoxinas bacterianas EP 2.6.14.
Según las regulaciones, se requiere la calificación de la matriz de muestra para inhibición y mejora antes de probar una nueva matriz de muestra.
