Pruebas de estabilidad genética

Análisis de estabilidad genética: pruebas de caracterización y estabilidad

La estabilidad genética es una caracterización específica de las células utilizadas en la producción de un biológico. Las células genéticamente modificadas contienen secuencias de inserción de transgén que codifican la proteína de interés. Los transgenes tienen el potencial de mutar, lo que puede afectar la calidad del producto o la correcta ejecución de los procesos.

Las directrices de la ICH establecen que es necesario caracterizar la estabilidad e integridad de la secuencia de inserción para garantizar una producción estable de la proteína correcta. Este es solo uno de los pasos necesarios para garantizar que la línea celular y el sistema de producción sean aceptables.

Existen múltiples técnicas para determinar la estabilidad genética de una línea celular. Estas pruebas se llevan a cabo durante la caracterización de una línea celular de producción y para evaluar la estabilidad genética del banco de células maestras y del banco de células de fin de producción. La prueba también se puede realizar en otros momentos, pero es particularmente útil durante las fases en las que hay cambios en el proceso de fermentación.

Sartorius ofrece los siguientes ensayos de estabilidad genética y puede asesorar sobre el enfoque más apropiado para su producto:

  • Pruebas de identidad de líneas celulares (códigos de barras de ADN, RAPD)

  • Número de copia genética

  • Secuenciación del transgén

  • Southern Blot 

Navegar por las regulaciones

El equipo de Sartorius le ayudará a orientar las normativas hasta el ensayo más adecuado para su aplicación.

Cree un plan de prueba personalizado

Nuestros expertos pueden ayudar a desarrollar ensayos de secuenciación genética personalizados para probar la estabilidad de su producto utilizando nuestro enfoque de plataforma.

Cumplimiento normativo

Nuestros ensayos que cumplen con las GMP se alinean con las pautas de la Farmacopea Europea (EP) y la Farmacopea de los Estados Unidos (USP).

Soluciones de Sartorius para el análisis de estabilidad genética
Soluciones de Sartorius para la caracterización y la estabilidad genéticaObjetivo

Ensayo de código de barras de ADN

Usando información de algunas regiones genéticas, este código de barras puede confirmar la identidad de la línea celular a nivel de especie.

Análisis de ADN polimórfico amplificado aleatorio (RAPD)

RAPD identifica mutaciones o células contaminantes, y normalmente se utiliza para comparar bancos de células de investigación, maestría, en funcionamiento o al final de la producción.
Número de copia del genRealizado en bancos de células recombinantes para confirmar el número de copias del transgén por célula.

Secuenciación de Sanger utilizando la plataforma ABI 3500

Confirmación de la estabilidad de la línea celular basada en la secuencia de ácido nucleico del transgén utilizado para producir la proteína de interés y la región flanqueante.

Southern blot analysis

Southern blots identify the presence of the transgene in a digest of the production cellular DNA, demonstrating its integrity.

  

Sartorius ofrece dos métodos para confirmar la identidad de la línea celular:

  • Ensayo de códigos de barras de ADN
  • Análisis de ADN polimórfico amplificado aleatorio (RAPD)

Ensayo de códigos de barras de ADN para identificar líneas celulares

Sartorius ofrece códigos de barras de ADN para las pruebas de caracterización de líneas celulares cGMP donde la identidad a nivel de especie para líneas celulares derivadas de mamíferos se puede determinar de acuerdo con las pautas regulatorias de ICH y CBER / FDA. Un método probado y verdadero ya conocido y en el que confían las autoridades reguladoras, el código de barras de ADN ahora se considera el método preferido para la determinación de especies.

El ensayo de códigos de barras de ADN de Sartorius ha sido validado para las siguientes líneas celulares; HeLa, HEK-293, MRC-5, CHO-K1, Vero, A9, MA104 y MDBK.

Análisis de ADN polimórfico amplificado aleatorio (RAPD)

Un método de prueba de identidad de línea celular alternativo al ensayo de código de barras de ADN es el análisis de ADN polimórfico amplificado aleatorio (RAPD). En este procedimiento, se utilizan 6 conjuntos de cebadores diferentes para amplificar regiones del genoma diana.

La determinación de la secuencia de ácido nucleico del transgén utilizado para producir la proteína de interés es una de las pruebas críticas que se llevan a cabo para determinar la estabilidad genética de la línea celular.

Durante las primeras etapas del desarrollo de un fármaco de proteína recombinante, se determina la secuencia de ARN mensajero (ARNm) del transgén tanto para el banco de células maestras (MCB) como para el banco de células de fin de producción (EOP). Esto revela evidencia que confirma que no hay cambios en el código genético y que las células no han sufrido cambios significativos.

Además de la región codificante, la región flanqueante del transgén también es una consideración importante ya que esto puede afectar la productividad y los niveles de expresión. La secuenciación de la región flanqueante (a nivel del ADN) está recomendada por las directrices de la ICH y debe considerarse antes de los ensayos clínicos de fase 3.

Sartorius utiliza la plataforma ABI 3500 para la secuenciación tradicional de Sanger basada en más de 25 años de experiencia en secuenciación de ácidos nucleicos con una amplia gama de diferentes organismos y tipos de muestras, incluidas proteínas recombinantes de células humanas y CHO.

Los servicios de secuenciación incluyen:

  • Secuenciación de alto rendimiento
  • Re-secuenciación de genes o regiones genómicas
  • Secuenciación de lectura única / múltiple
  • Diseño de imprimación
  • Amplificación y / o purificación por PCR

Como uno de los métodos más antiguos para analizar el ADN, el Southern Blot ofrece un compendio de una muestra de ADN separada por electroforesis en gel según el tamaño de los fragmentos generados. A continuación, se identifican regiones diana de ADN específicas usando una sonda de ácido nucleico.

Las pruebas de Southern Blot identifican la presencia del transgén en un compendio de producción de ADN celular. En los casos en los que hay múltiples copias del transgén en una línea celular de producción, Southern Blot identificará cada secuencia objetivo a medida que se dispersan a lo largo del genoma o producirá una banda más intensa donde más de una secuencia de inserción se colocan adyacentes entre sí .

Esto permite que la transferencia de Southern revele información aproximada sobre el número de copias del transgén y las muestras de los bancos de células maestras y los bancos de células de fin de producción se pueden comparar en la misma transferencia para demostrar similitud.

La identificación del número de copias del transgén se considera un indicador de estabilidad crítico para la productividad en CHO y otras líneas celulares utilizadas en la producción de proteínas recombinantes.

Las líneas celulares que mantienen niveles consistentes de productividad tienen un número constante de copias de transgén, mientras que las líneas celulares que exhiben una pérdida de productividad demostraron desviación con los pases. La PCR cuantitativa es el método de elección para determinar el número de copias de un clon. Sartorius ofrece un servicio completo desde el diseño y la validación de ensayos hasta la calificación de muestras.

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