Retrovirus
Satisfaciendo sus necesidades de pruebas de retrovirus
Los retrovirus son una familia de virus con un ciclo de vida extremadamente complicado. Son de particular preocupación porque a menudo están presentes en una forma endógena como pro-virus en muchas, si no en todas, las líneas celulares de producción. Las células CHO, por ejemplo, tienen un virus endógeno que es capaz de generar una partícula de virus visible por microscopía electrónica de transmisión (TEM). Esto no es infeccioso, pero algunas líneas de células de ratón, como NS0, producirán un retrovirus infeccioso.
Las Directrices del Consejo Internacional para la Armonización de Requisitos Técnicos para Productos Farmacéuticos de Uso Humano (ICH) (Sección 3.2.1) describen las pruebas de retrovirus que se aplican a tres etapas del proceso de fabricación: el banco de células maestro (MCB), el final de la producción (EOP) bancos de células y la cosecha a granel. Las pruebas descritas en las pautas incluyen ensayos de infectividad en cultivos de células sensibles y estudios TEM. Solo se requieren más pruebas si no se detecta un retrovirus infeccioso, y TEM no ha observado retrovirus o partículas similares a retrovirus. En este caso, se debe utilizar un ensayo para la detección de transcriptasa inversa retroviral.
Nuestros expertos diseñan un plan de prueba de retrovirus en torno a sus necesidades de desarrollo de medicamentos o productos comerciales.
Los planes de prueba listos para usar y de calidad garantizada y las pruebas cGMP prevalidadas permiten el acceso inmediato a pruebas especializadas y resultados más rápidos
Nuestros expertos interpretan los resultados de las líneas celulares que se sabe que contienen retrovirus endógenos, lo que proporciona un camino a seguir para la liberación de productos / presentación regulatoria.
Nuestros ensayos que cumplen con las GMP se alinean con las pautas de la Farmacopea europea (EP) y la Farmacopea de los Estados Unidos (USP).
Las recomendaciones de las pruebas dependen de la especie de la línea celular que se utilice para fabricar el producto. Las líneas celulares que no se sabe que contengan retrovirus endógenos (líneas celulares humanas o de primates) típicamente deben mostrar resultados negativos de TEM y transcriptasa inversa mejorada por producto (PERT). Las líneas celulares que se sabe que contienen retrovirus endógenos (líneas celulares de hámster) deben mostrar resultados TEM positivos y resultados negativos de un ensayo de infectividad basado en células. Las recomendaciones de las pruebas también dependen del uso previsto del producto (por ejemplo, producción de proteínas recombinantes, producción de vacunas, vacuna viral, terapia génica con vectores virales).
Pueden estar presentes partículas similares a virus (VLP), pero se debe demostrar que no son infecciosas.
| Muestreado de | Microscopía electrónica de transmisión (TEM) | Producto de transcriptasa inversa mejorada (PERT) | Ensayo S + L extendido |
|---|---|---|---|
Banco de células de investigación | - | - | - |
| Banco de células maestras | X | X | X* |
Banco de células de trabajo | - | - | X* |
Banco de células de fin de producción | X | X | X* |
Stock de semilla de virus maestro | X | X | - |
| Stock de semillas de virus de trabajo | - | X | - |
Cosecha a granel sin purificar | X | X | X* |
| Substancia de droga | - | - | - |
| Producto de medicamento | - | - | - |
X* – murine-based cell lines only (e.g., - hamster)
Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
Examen de 200 perfiles de células
En esta prueba, utilizada principalmente para bancos de células de mamíferos, se analizan por lo menos 200 perfiles de células medianas (células con núcleos) para TEM. Las partes clave de las células (núcleo celular, orgánulos celulares, cuerpos de Golgi y la membrana plasmática) se examinan de cerca. Este ensayo busca ver que la morfología celular permanezca intacta. También identifica virus, partículas similares a virus, hongos, levaduras, bacterias y micoplasmas, y registra el porcentaje de perfiles celulares con los que están asociados. Para los retrovirus identificados, se registra el tipo de partícula viral. Este ensayo proporciona datos cuantitativos y cualitativos para el producto, acompañados de un visual TEM para las presentaciones.
Sección thin
Otro método empleado, principalmente para preparaciones de recolección a granel, es la microscopía electrónica de sección delgada. Se preparan secciones ultrafinas del material de prueba utilizando un cuchillo de diamante y un micrótomo y luego se tiñen con acetato de uranilo y citrato de plomo. Las partículas virales se cuentan a partir de 10 cuadrículas al azar y se calcula el título.
Negative Staining
Negative staining allows for a high-magnification TEM study of biological specimens to determine morphology and ultrastructure. An electron-opaque stain is applied directly to biological samples from suspension fluids. The stain surrounds and penetrates the specimen, creating contrast between the biological material and its background. The sample is mixed with a known concentration of latex beads as reference, which makes it possible to generate a titer of virus like particles for the sample.
FPERT
Los ensayos de transcriptasa inversa mejorada con productos fluorescentes (FPERT) son pruebas muy sensibles que miden la actividad de la transcriptasa inversa, una enzima que transcribe el ADN del ARN y está presente en todos los retrovirus.
Como método basado en qPCR, los resultados se pueden generar más rápidamente que los métodos TEM y basados en células.
Ensayo S+L
El Ensayo Extendido S + L es una prueba límite para la presencia de retrovirus infecciosos dentro de muestras de bancos de células MCB, WCB o EoP donde se requiere la detección de retrovirus murinos infecciosos (principalmente para probar bancos de células CHO o bancos de células murinas).
Las células de Mus dunni pueden soportar la infección de las cuatro clases de virus de leucemia murina (MLV), con la excepción de Moloney MLV. Usando líneas celulares de punto final MiCl1 y PG4, este ensayo es capaz de detectar una serie de retrovirus murinos infecciosos xenotrópicos y anfotrópicos.
