Caracterización biofísica (caracterización y confirmación estructural)
Las terapias basadas en proteínas se producen en células vivas, lo que da como resultado un grado inherente de heterogeneidad estructural. Caracterizar la heterogeneidad estructural inherente es un requisito esencial para el desarrollo de un anticuerpo monoclonal terapéutico. Las modificaciones postraduccionales pueden afectar la estabilidad in vivo, la pérdida de actividad biológica y provocar efectos inmunitarios no deseados.
Sartorius proporciona el apoyo y el asesoramiento necesarios para mitigar estos riesgos garantizando que la estructura de las proteínas y los análisis fisicoquímicos se realicen en las etapas adecuadas del desarrollo de proteínas terapéuticas. Ofrecemos una amplia gama de métodos para caracterizar y confirmar la estructura de las proteínas, el perfil de carbohidratos y las modificaciones postraduccionales utilizando técnicas de vanguardia para garantizar que se cumplan las pautas científicas de ICH Q6B, lo que da como resultado un proceso de desarrollo eficiente y optimizado.
Ofrecemos tres métodos para evaluar las glicoformas en proteínas intactas en cualquier etapa de su programa.
Ofrecemos caracterización estructural y fisicoquímica, combinada con análisis biológicos complejos, para caracterizar completamente su proteína.
Para moléculas estándar como IgG, hemos precalificado nuestros ensayos para un despliegue rápido.
Podemos asociarnos con usted desde la caracterización de clones en la fase inicial hasta la liberación de lotes completa compatible con cGMP, con soluciones personalizadas en cada etapa
| Requisitos de ICH Q6B | Nuestras soluciones | ||
|---|---|---|---|
Estructura de carbohidratos | Labchip con nuestro desarrollo de la línea Cellca Cell (enlace) para CLD en fase temprana (pool to clone, en línea) | N-glicano liberado por UHPLC para CLD de fase tardía (selección de clon final) | N-glicano liberado por LC / MS para una caracterización en profundidad |
| Secuencia de aminoácidos | Mapeo de péptidos, digestión de enzima única para una cobertura> 95% | Mapeo de péptidos, digestión de múltiples enzimas para una cobertura del 100% | Masa intacta para el aseguramiento preliminar de la identidad de las proteínas |
| Composición de aminoácidos | Análisis de aminoácidos | ||
| Secuencia de aminoácidos terminal | Mapeo de péptidos | ||
Mapa de péptidos y modificaciones postraduccionales | Mapeo de péptidos | Masa intacta | |
| Grupo (s) sulfhidrilo y puentes disulfuro | Mapeo de péptidos no reducidos | ||
Estructura de carbohidratos
La presencia y abundancia de estructuras de glucanos conjugadas post-traduccionalmente al anticuerpo monoclonal influyen en una serie de características, como la estructura de la molécula, la función efectora y la estabilidad, lo que crea un serio desafío en el desarrollo de terapias con anticuerpos.
Análisis de N-glicanos publicado por LC / MS
Sartorius ofrece un ensayo de N-glicano lanzado para el perfil en profundidad de la glicosilación de IgG. Los glicanos se eliminan enzimáticamente del anticuerpo y luego se marcan antes de realizar una separación por cromatografía líquida de alta resolución (CL) (consulte el cromatograma a continuación).
La detección de fluorescencia junto con la espectrometría de masas (MS) ESI en línea permite una asignación segura y una cuantificación precisa de las diferentes estructuras de glicanos. A continuación, estos pueden agruparse de acuerdo con su clasificación estructural (por ejemplo, complejo, oligomanosa) y composición de monosacáridos, como perfiles de fucosa, galactosa y ácido siálico.
El cromatograma muestra las principales glicoformas identificadas, en relación con el pico de GOF más abundante establecido en 100%.
Secuencia y composición de aminoácidos
El mapeo de péptidos es la técnica principal para confirmar la estructura primaria de una proteína (secuencia de aminoácidos). La proteína se digiere mediante una enzima proteolítica y los péptidos resultantes se analizan mediante cromatografía líquida y espectrometría de masas (LC-MS). Nuestro método de mapeo de péptidos combina una estrategia de digestión eficiente, separación por LC de ultra alto rendimiento y MS de alta resolución para una caracterización de proteínas en profundidad.
Vías de digestión múltiple
Comúnmente, la tripsina se usa como proteasa para el mapeo de péptidos debido a su alta especificidad por los residuos de lisina y arginina. Sin embargo, puede ser necesario utilizar otras enzimas en los casos en los que la tripsina sola no proporciona una cobertura de secuencia del 100% o la proteína de interés es resistente a la actividad de la tripsina.
El mapeo de péptidos se puede realizar usando una variedad de enzimas proteolíticas, con especificidad ortogonal a la tripsina, para obtener diferentes rutas de fragmentación de péptidos y lograr una confianza adicional para la verificación de la secuencia mediante el uso de péptidos superpuestos.
Mapa de péptidos
Al confirmar la secuencia de aminoácidos que constituye la estructura primaria de una proteína, el método de elección es el mapeo de péptidos. Después de usar una enzima proteolítica para digerir la proteína, los péptidos restantes están listos para el análisis por cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). Nuestro método de mapeo de péptidos combina una estrategia de digestión eficiente, separación LC de rendimiento ultra alto y MS de alta resolución para una caracterización profunda de proteínas.
Modificaciones postraduccionales
El mapeo de péptidos forma una parte importante del análisis de la estructura de proteínas, ya que también permite la caracterización analítica de una variedad de modificaciones postraduccionales (PTM), que incluyen: desamidación, oxidación, ácido piroglutámico N-terminal, recorte de lisina C-terminal y glicosilación.
El mapeo de péptidos también se puede realizar sin reducción de los enlaces disulfuro para determinar las posiciones de los puentes disulfuro y / o tioles libres (grupos sulfhidrilo).
