Propiedades fisicoquímicas
Las terapias basadas en proteínas se producen en células vivas, lo que da como resultado un grado inherente de heterogeneidad. Caracterizar la heterogeneidad estructural inherente es un requisito esencial para el desarrollo de un anticuerpo monoclonal terapéutico. Las especies de alto y bajo peso molecular, las variantes de carga y las modificaciones postraduccionales pueden afectar la estabilidad in vivo, causar pérdida de actividad biológica y efectos inmunes no deseados.
Al verificar la estructura de las proteínas y los análisis fisicoquímicos en las etapas adecuadas del desarrollo de una proteína terapéutica, el equipo de Sartorius ayuda a garantizar que estos riesgos se gestionen de forma eficaz.
Sartorius ofrece una amplia gama de métodos para caracterizar y confirmar la estructura de las proteínas, el perfil de carbohidratos, las modificaciones postraduccionales y las impurezas. Utilizamos técnicas de vanguardia para garantizar que se cumplan las pautas científicos ICH Q6B, lo que da como resultado un proceso de desarrollo eficiente y optimizado.
Caracterización avanzada de proteínas con análisis ortogonal de alta resolución de propiedades fisicoquímicas clave
Intact mass analysis not only provides preliminary assurance of identity, but can inform on secondary structure and post translation modifications
La caracterización estructural y fisicoquímica combinada con un análisis biológico complejo permite una comprensión profunda de su proteína
Para moléculas estándar como las IgG, tenemos ensayos precalificados listos para usar
Requisitos de ICH Q6B | Nuestras soluciones | ||
|---|---|---|---|
| Análisis de peso y tamaño molecular | Masa intacta y reducida | Cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) | SDS de electroforesis capilar (CE-SDS) |
| Patrón de isoformas | Cromatografía de intercambio iónico (IEX) | Enfoque isoeléctrico capilar (cIEF) | Perfilado LC / MS de fase inversa para isoformas de IgG2 |
| Coeficiente de extinción | Análisis de concentración de proteínas | ||
| Patrones electroforéticos | SDS de electroforesis capilar (CE-SDS) | Enfoque isoeléctrico capilar (cIEF) | |
| Patrones de cromatografía líquida | Cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) | Cromatografía de intercambio iónico (IEX) | Cromatografía de fase inversa |
| Perfiles espectroscópicos | Ofrecemos CD, NMR y FTIR a través de un laboratorio asociado aprobado | ||
Peso y tamaño molecular
La determinación del peso molecular es esencial para la seguridad preliminar de que el producto recombinante se sintetiza como se esperaba. La medición del peso molecular puede indicar una posible variación de secuencia y proporcionar una evaluación de alto nivel de la modificación postraduccional, incluida la glicosilación. Nuestros métodos LC-MS de alta resolución proporcionan información precisa sobre el peso molecular y complementan nuestros métodos SDS de electroforesis capilar y cromatográfica de exclusión por tamaño.
Nuestro equipo dedicado y experimentado tiene métodos para evaluar la masa de proteína intacta, proteína desglicosilada y proteína reducida.
El análisis de masa intacta es el proceso de determinar el peso molecular de una proteína. La comparación de la masa observada con la masa esperada de la secuencia primaria proporciona una garantía preliminar de la composición de aminoácidos. El análisis de masa intacta también proporciona información sobre la naturaleza de las principales glicoformas de proteínas, así como otras modificaciones importantes.
La desglicosilación de una IgG antes del análisis por LC / MS elimina la heterogeneidad asociada con la N-glicosilación. Esto se emplea para evaluar la masa del esqueleto proteico sin los glucanos unidos. Junto con los datos de masa intactos, este método proporciona una validación indirecta de la estructura primaria.
El análisis LC / MS del anticuerpo monoclonal reducido se usa para confirmar el peso molecular de las cadenas ligeras y pesadas individuales. Además de confirmar los datos para la masa intacta y desglicosilada, el análisis de fragmentos de proteína más pequeños significa que el método es más sensible a modificaciones menos abundantes.
Nuestro equipo también puede proporcionar análisis complementarios sobre variantes de tamaño utilizando CE-SDS y SEC. Estas técnicas proporcionan un enfoque ortogonal para la evaluación de isoformas de tamaño y peso molecular
La electroforesis capilar (CE) se ha convertido en un sustituto eficaz de la electroforesis manual en placa en gel debido a su automatización, cuantificación, velocidad y alta eficiencia. La técnica CE-SDS de Sartorius proporciona información sobre las variantes de tamaño de su proteína.
La cromatografía de exclusión por tamaño utiliza métodos cromatográficos de baja dispersión y alta resolución para identificar variantes de alto y bajo peso molecular de su anticuerpo monoclonal mientras se evalúan las consecuencias en la actividad de unión y funcional. Esto también proporciona información sobre patrones cromatográficos, que es requerido por el ICH Q6b para la identidad, homogeneidad y pureza.
Patrón cromatográfico líquido
Los productos de agregación y degradación de proteínas, así como la heterogeneidad en las variantes de carga, son características fundamentales implicadas en la estabilidad, actividad biológica e inmunogenicidad del anticuerpo monoclonal terapéutico. Estas características pueden ser indicativas de la naturaleza de la línea celular clonal, el proceso de fabricación o la estabilidad del fármaco, información que se necesita durante todo el ciclo de desarrollo biológico.
La cromatografía de exclusión por tamaño utiliza métodos cromatográficos de baja dispersión y alta resolución para identificar variantes de alto y bajo peso molecular de un anticuerpo monoclonal mientras se evalúan las consecuencias en la actividad de unión y funcional. Esto también proporciona información sobre los patrones cromatográficos, que es requerido por el ICH Q6b para la identidad, homogeneidad y pureza.
Utilizando métodos cromatográficos, es posible separar proteínas de acuerdo con su carga neta global basada en el punto isoeléctrico (pI). La cromatografía de intercambio iónico (IEX) es una técnica poderosa para distinguir entre moléculas que tienen diferencias menores en la carga neta. Debido a las propiedades anfóteras de varias cadenas laterales de aminoácidos, esta característica es fundamental para comprender la heterogeneidad de lo biológico.
La realización de cromatografía en fase inversa (RP) respalda la caracterización de anticuerpos monoclonales al revelar información importante sobre la pureza del producto. La separación se basa en la hidrofobicidad y, por lo tanto, la cromatografía RP ofrece una selectividad ortogonal a otras técnicas, como la cromatografía de exclusión por tamaño y la cromatografía de intercambio iónico. Es particularmente relevante para las IgG2, que pueden tener formas estructuralmente distintas causadas por diferentes estructuras de enlaces disulfuro.
Patrón electroforético
Los productos de agregación y degradación de proteínas, así como la heterogeneidad en las variantes de carga, son características fundamentales implicadas en la estabilidad, actividad biológica e inmunogenicidad del anticuerpo monoclonal terapéutico. Estas características pueden ser indicativas de la naturaleza de la línea celular clonal, el proceso de fabricación o la estabilidad del fármaco, información que se necesita durante todo el ciclo de desarrollo biológico.
Ejemplo de electroferograma para el estándar NIST mAb
La electroforesis capilar (CE) se ha convertido en un sustituto eficaz de la electroforesis manual en gel en placa debido a su automatización, cuantificación, velocidad y alta eficiencia. La técnica CE-SDS de Sartorius proporciona información sobre las variantes de tamaño de su proteína.
El enfoque isoeléctrico capilar (cIEF) es una técnica de dos pasos que separa las variantes de carga en función de su punto isoeléctrico (pI). Los valores de pI se pueden determinar mediante patrones de proteínas con valores de pI conocidos. cIEF es una técnica ortogonal realizada con IEX y ejecutada con el sistema SCIEX 800.
Análisis de variantes de carga
Las variantes de carga de un producto biológico pueden tener implicaciones en la estabilidad y la función biológica. La heterogeneidad de carga puede ser causada por variantes de secuencia (por ejemplo, recorte de lisina C-terminal), productos de degradación química (por ejemplo, desamidación) y alguna modificación postraduccional (por ejemplo, glicanos que contienen ácido siálico). La variabilidad puede ser inherentemente característica de la línea celular huésped o puede introducirse mediante métodos de fabricación comerciales. La comprensión y la gestión de esta heterogeneidad están implícitas en los requisitos deICH Q6b.
Utilizando métodos cromatográficos, es posible separar proteínas de acuerdo con su carga neta global basada en el punto isoeléctrico (pI). La cromatografía de intercambio iónico (IEX) es una técnica poderosa para distinguir entre moléculas que tienen diferencias menores en la carga neta. Debido a las propiedades anfóteras de varias cadenas laterales de aminoácidos, esta característica es fundamental para comprender la heterogeneidad de lo biológico.
El enfoque isoeléctrico capilar (cIEF) es una técnica de dos pasos que separa las variantes de carga en función de su punto isoeléctrico (pI). Los valores de pI se pueden determinar mediante patrones de proteínas con valores de pI conocidos. cIEF es una técnica ortogonal realizada con IEX y ejecutada con el sistema SCIEX 800.
Perfiles de LC / MS de fase inversa para isoformas de IgG2
La cromatografía líquida de fase inversa (LC) acoplada a la espectrometría de masas (MS) de alta resolución es un poderoso enfoque analítico para la elaboración de perfiles de terapias de mAb. La combinación de separaciones de alto rendimiento e información de masa precisa puede proporcionar información detallada sobre la heterogeneidad y estabilidad de los anticuerpos. Sin embargo, hasta la fecha, las separaciones cromatográficas de mayor resolución de proteínas intactas se han basado en reactivos de emparejamiento de iones, que pueden comprometer la sensibilidad de la EM.
Para facilitar la caracterización de los anticuerpos IgG2, Sartorius desarrolló un método que combina separaciones de proteínas intactas de alta resolución con una alta sensibilidad a la EM. Aprovechando los avances recientes en las tecnologías de columna, este enfoque logró una excelente resolución de las diferentes isoformas de IgG2 y se detectaron varias especies adicionales. Además, el uso de un reactivo de apareamiento de iones novedoso mejora la sensibilidad de la EM, lo que permite lograr espectros de masas de alta calidad para cada especie.
Example electropherogram for NIST mAb standard
Análisis de concentración de proteínas
La determinación de la concentración de proteínas debe realizarse en un gran número de muestras como primer paso al analizar una muestra de proteína bioterapéutica, ya que conocer la concentración es fundamental para aplicar los ensayos.
La espectrofotometría es una técnica bien establecida para este análisis. Implica pasar luz a una longitud de onda específica a través de la muestra y medir la absorbancia. La longitud de onda comúnmente utilizada para este proceso es de 280 nm, debido a la fuerte absorbancia de los aminoácidos aromáticos en esta región del espectro UV, por lo que a menudo se denomina análisis A280. La absorbancia está relacionada con la concentración mediante la ley de Beer-Lambert:
A = εCL
Donde A = absorbancia, ε = coeficiente de extinción, C = concentración y L = longitud de trayectoria
Cuando se utiliza un espectrofotómetro de longitud de trayectoria fija, a menudo se requieren diluciones cuidadosas para llevar la concentración de las muestras dentro del rango lineal del instrumento. Esto puede llevar mucho tiempo y cualquier error asociado con las diluciones dará lugar a errores en la concentración final calculada para la muestra.
Una solución a estos problemas es utilizar un instrumento de longitud de trayectoria variable que altere el componente de longitud de trayectoria de la ley de Beer-Lambert. Al alterar la longitud de la trayectoria en lugar de la concentración, generalmente no se requieren diluciones. El ensayo desarrollado por Sartorius es exacto y preciso. Se puede analizar una gran cantidad de muestras en un corto período de tiempo en comparación con un espectrofotómetro de longitud de trayectoria fija. Otro beneficio es que la muestra se puede recuperar después del análisis, lo que es especialmente útil cuando solo se dispone de una pequeña cantidad de muestra y se requieren varias pruebas diferentes.
