Caracterização Biofísica (Caracterização Estrutural e Confirmação)
A terapêutica baseada em proteínas é produzida em células vivas, resultando em um grau inerente de heterogeneidade estrutural. A caracterização da heterogeneidade estrutural inerente é um requisito essencial para o desenvolvimento de um anticorpo monoclonal terapêutico. Modificações pós-tradução podem afetar a estabilidade in vivo, perda de atividade biológica e causar efeitos imunológicos indesejados.
A Sartorius fornece o suporte e o conselho necessários para mitigar esses riscos, garantindo que a estrutura da proteína e as análises físico-químicas sejam realizadas em estágios apropriados do desenvolvimento de proteínas terapêuticas. Oferecemos uma gama abrangente de métodos para caracterizar e confirmar a estrutura da proteína, perfil de carboidratos e modificações pós-tradução usando técnicas de ponta para garantir que as diretrizes científicas ICH Q6B sejam atendidas, resultando em um processo de desenvolvimento eficiente e simplificado.
Oferecemos três métodos para avaliar glicoformas em proteínas intactas em qualquer estágio de seu programa
Oferecemos caracterização estrutural e físico-química, combinada com análises biológicas complexas, para caracterizar completamente sua proteína
Para moléculas padrão como IgGs, pré-qualificamos nossos ensaios para implantação rápida
Podemos fazer parceria com você desde a caracterização do clone de fase inicial até o lançamento de lote totalmente compatível com cGMP, com soluções personalizadas em cada estágio
| Requisitos ICH Q6B | Nossas Soluções | ||
|---|---|---|---|
| Estrutura de carboidratos | Labchip com nosso desenvolvimento de linha celular Cellca (link) para CLD de fase inicial (pool to clone, inline) | Lançado N-glicano por UHPLC para CLD de fase tardia (seleção final do clone) | Lançado N-glicano por LC / MS para caracterização aprofundada |
| Sequência de aminoácidos | Mapeamento de peptídeos, digestão de enzima única para> 95% de cobertura | Mapeamento de peptídeos, digestão de múltiplas enzimas para cobertura de 100% | Massa intacta para garantia preliminar de identidade de proteína |
| Composição de aminoácidos | Análise de aminoácidos | ||
| Sequência de aminoácidos terminal | Mapeamento de peptídeo | ||
| Mapa de peptídeos e modificações pós-tradução | Mapeamento de peptídeo | Massa intacta | |
| Grupo (s) sulfidrila e pontes dissulfeto | Mapeamento de peptídeo não reduzido | ||
Análise de N-Glycan liberada por LC / MS
A Sartorius oferece um ensaio de N-glicano lançado para o perfil detalhado da glicosilação de IgG. Os glicanos são removidos enzimaticamente do anticorpo e então rotulados antes de uma separação por cromatografia líquida de alta resolução (LC) ser realizada (ver cromatograma abaixo).
A detecção de fluorescência juntamente com a espectrometria de massa (MS) ESI online permite a atribuição confiável e a quantificação precisa das diferentes estruturas de glicano. Estes podem então ser agrupados de acordo com sua classificação estrutural (por exemplo, complexo, oligomanose) e composição de monossacarídeo, como perfis de fucose, galactose e ácido siálico.
O cromatograma mostra as principais glicoformas identificadas, em relação ao pico de GOF mais abundante definido como 100%.
Vias Múltiplas Digest
Comumente, a tripsina é usada como uma protease para mapeamento de peptídeos devido à sua alta especificidade para resíduos de lisina e arginina. No entanto, pode haver uma necessidade de usar outras enzimas nos casos em que a tripsina sozinha não fornece cobertura de sequência de 100% ou a proteína de interesse é resistente à atividade da tripsina.
O mapeamento de peptídeos pode ser realizado usando uma variedade de enzimas proteolíticas, com especificidade ortogonal para tripsina, para obter diferentes vias de fragmentação de peptídeos e obter confiança adicional para verificação de sequência por meio do uso de peptídeos sobrepostos.
Modificações pós-traducionais
O mapeamento de peptídeos constitui uma parte importante da análise da estrutura da proteína, pois também permite a caracterização analítica de uma variedade de modificações pós-tradução (PTMs), incluindo: desamidação, oxidação, ácido piroglutâmico N-terminal, corte de lisina C-terminal e glicosilação.
O mapeamento de peptídeos também pode ser realizado sem redução das ligações dissulfeto para determinar as posições das pontes dissulfeto e / ou tióis livres (grupos sulfidrila).
