Propriedades físico-químicas
A terapêutica baseada em proteínas é produzida em células vivas, o que resulta em um grau inerente de heterogeneidade. A caracterização da heterogeneidade estrutural inerente é um requisito essencial para o desenvolvimento de um anticorpo monoclonal terapêutico. Espécies de alto e baixo peso molecular, variantes de carga e modificações pós-tradução podem afetar a estabilidade in vivo, causar perda de atividade biológica e efeitos imunológicos indesejados.
Ao verificar a estrutura da proteína e as análises físico-químicas em estágios apropriados do desenvolvimento de uma proteína terapêutica, a equipe da Sartorius ajuda a garantir que esses riscos sejam gerenciados de forma eficaz.
A Sartorius oferece uma gama abrangente de métodos para caracterizar e confirmar a estrutura da proteína, perfil de carboidratos, modificações pós-tradução e impurezas. Usamos técnicas de última geração para garantir que as diretrizes científicas do ICH Q6B sejam atendidas, resultando em um processo de desenvolvimento eficiente e simplificado.
Caracterização avançada de proteínas com análise ortogonal de alta resolução das principais propriedades físico-químicas
A análise de massa intacta não só fornece garantia preliminar de identidade, mas pode informar sobre a estrutura secundária e modificações pós-tradução
A caracterização estrutural e físico-química combinada com análises biológicas complexas permite um entendimento completo de sua proteína
Para moléculas padrão como IgGs, temos ensaios pré-qualificados prontos para uso
| Requisitos ICH Q6B | Nossas Soluções | ||
|---|---|---|---|
| Peso molecular e análise de tamanho | Massa intacta e reduzida | Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) | Eletroforese Capilar SDS (CE-SDS) |
| Padrão isoforma | Cromatografia de troca iônica (IEX) | Focalização isoelétrica capilar (cIEF) | Perfil de LC / MS de fase reversa para isoformas de IgG2 |
| Coeficiente de extinção | Análise de concentração de proteína | ||
| Padrões eletroforéticos | Eletroforese Capilar SDS (CE-SDS) | Focalização isoelétrica capilar (cIEF) | |
| Padrões cromatográficos líquidos | Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) | Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) | Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) |
| Perfis espectroscópicos | Oferecemos CD, NMR e FTIR por meio de um laboratório parceiro aprovado | ||
A análise de massa intacta é o processo de determinação do peso molecular de uma proteína. A comparação da massa observada com a massa esperada da sequência primária fornece uma garantia preliminar da composição de aminoácidos. A análise de massa intacta também fornece informações sobre a natureza das principais glicoformas de proteínas, bem como outras modificações importantes.
A desglicosilação de uma IgG antes da análise por LC / MS remove a heterogeneidade associada à N-glicosilação. Isso é empregado para avaliar a massa do esqueleto da proteína sem os glicanos anexados. Junto com os dados de massa intactos, este método fornece validação indireta da estrutura primária.
A análise LC / MS do anticorpo monoclonal reduzido é usada para confirmar o peso molecular das cadeias leves e pesadas individuais. Além de confirmar os dados para a massa intacta e desglicosilada, a análise de fragmentos de proteínas menores significa que o método é mais sensível a modificações menos abundantes.
Nossa equipe também pode fornecer análises complementares em variantes de tamanho usando CE-SDS e SEC. Estas técnicas fornecem uma abordagem ortogonal para avaliação do peso molecular e isoformas de tamanho
A eletroforese capilar (CE) tornou-se um substituto eficaz para a eletroforese em gel de placa manual devido à sua automação, quantificação, velocidade e alta eficiência. A técnica CE-SDS da Sartorius fornece informações sobre as variantes de tamanho de sua proteína.
A cromatografia de exclusão de tamanho usa métodos cromatográficos de baixa dispersão e alta resolução para identificar variantes de alto e baixo peso molecular de seu anticorpo monoclonal enquanto avalia a consequência na atividade de ligação e funcional. Isso também fornece informações sobre os padrões cromatográficos, que são exigidos pelo ICH Q6b para identidade, homogeneidade e pureza.
A cromatografia de exclusão de tamanho usa métodos cromatográficos de baixa dispersão e alta resolução para identificar variantes de alto e baixo peso molecular de um anticorpo monoclonal enquanto avalia a consequência na atividade de ligação e funcional. Isso também fornece informações sobre os padrões cromatográficos, que são exigidos pelo ICH Q6b para identidade, homogeneidade e pureza.
Usando métodos cromatográficos, é possível separar as proteínas de acordo com sua carga líquida total com base no ponto isoelétrico (pI). A cromatografia de troca iônica (IEX) é uma técnica poderosa para distinguir entre moléculas que têm pequenas diferenças na carga líquida. Devido às propriedades anfotéricas de várias cadeias laterais de aminoácidos, essa característica é fundamental para o entendimento da heterogeneidade do biológico.
A cromatografia de fase reversa (RP) auxilia na caracterização de anticorpos monoclonais, revelando informações importantes sobre a pureza do produto. A separação é baseada na hidrofobicidade e, portanto, a cromatografia RP oferece seletividade ortogonal para outras técnicas, como cromatografia de exclusão de tamanho e cromatografia de troca iônica. É particularmente relevante para IgG2s, que podem ter formas estruturalmente distintas causadas por diferentes estruturas de ligação dissulfeto.
Os produtos de agregação e degradação de proteínas, bem como a heterogeneidade das variantes de carga, são características fundamentais implicadas na estabilidade, atividade biológica e imunogenicidade do anticorpo monoclonal terapêutico. Essas características podem ser indicativas da natureza da linha celular clonal, do processo de fabricação ou da estabilidade do medicamento - informações que são necessárias ao longo do ciclo de desenvolvimento biológico.
Eletroferograma de exemplo para o padrão de mAb NIST
Usando métodos cromatográficos, é possível separar as proteínas de acordo com sua carga líquida total com base no ponto isoelétrico (pI). A cromatografia de troca iônica (IEX) é uma técnica poderosa para distinguir entre moléculas que têm pequenas diferenças na carga líquida. Devido às propriedades anfotéricas de várias cadeias laterais de aminoácidos, essa característica é fundamental para o entendimento da heterogeneidade do biológico.
A focagem isoelétrica capilar (cIEF) é uma técnica de duas etapas que separa as variantes de carga com base em seu ponto isoelétrico (pI). Os valores de pI podem ser determinados através de padrões de proteína com valores de pI conhecidos. cIEF é uma técnica ortogonal feita com IEX e executada usando o sistema SCIEX 800.
Perfil de LC / MS de fase reversa para isoformas de IgG2
A cromatografia líquida de fase reversa (LC) acoplada à espectrometria de massa de alta resolução (MS) é uma abordagem analítica poderosa para o perfil de terapêuticas de mAb. A combinação de separações de alto desempenho e informações de massa precisas podem fornecer percepções detalhadas sobre a heterogeneidade e estabilidade do anticorpo. No entanto, até o momento, as separações cromatográficas de maior resolução de proteínas intactas dependem de reagentes de emparelhamento de íons, o que pode comprometer a sensibilidade do MS.
Para facilitar a caracterização de anticorpos IgG2, a Sartorius desenvolveu um método que combina separações de proteínas intactas de alta resolução com alta sensibilidade de MS. Aproveitando os avanços recentes em tecnologias de coluna, esta abordagem alcançou excelente resolução das diferentes isoformas de IgG2, e uma série de espécies adicionais foram detectadas. Além disso, o uso de um novo reagente de emparelhamento de íons melhora a sensibilidade de MS, permitindo a obtenção de espectros de massa de alta qualidade para cada espécie.
Example electropherogram for NIST mAb standard
A espectrofotometria é uma técnica bem estabelecida para essa análise. Envolve a passagem de luz em um comprimento de onda especificado através da amostra e a medição da absorbância. O comprimento de onda comumente usado para este processo é de 280 nm, devido à forte absorvância de aminoácidos aromáticos nesta região do espectro de UV, motivo pelo qual é frequentemente referido como análise A280. A absorbância está relacionada à concentração usando a lei de Beer-Lambert:
A = εCL
Onde A = absorbância, ε = coeficiente de extinção, C = concentração e L = comprimento do caminho
Ao usar um espectrofotômetro de caminho óptico fixo, muitas vezes são necessárias diluições cuidadosas para colocar a concentração das amostras dentro da faixa linear do instrumento. Isso pode ser demorado e quaisquer erros associados às diluições levarão a erros na concentração final calculada para a amostra.
Uma solução para esses problemas é usar um instrumento de comprimento de caminho variável que altera o componente de comprimento de caminho da lei de Beer-Lambert. Ao alterar o comprimento do caminho em vez da concentração, geralmente não são necessárias diluições. O ensaio desenvolvido pela Sartorius é exato e preciso. Um grande número de amostras pode ser analisado em um curto período de tempo em comparação com um espectrofotômetro de comprimento de caminho fixo. Outro benefício é que a amostra pode ser recuperada após a análise, o que é especialmente útil quando apenas uma pequena quantidade de amostra está disponível e vários testes diferentes são necessários.
Comprimento de caminho fixo - Análise de concentração de proteína
