Experimento: Purificación de proteínas y ensayos
Una preparación cuidadosa asegura el éxito experimental. Ya sea que esté realizando experimentos de curso temporal, analizando la expresión de proteínas o realizando ensayos para el desarrollo de fármacos, todas sus herramientas deben funcionar de manera óptima para generar datos confiables.
Para ayudarlo a pasar de la campana al banco, ofrecemos una variedad de tecnologías para purificar proteínas y observar la actividad celular.
Si el propósito de su cultivo celular es la purificación de proteínas, es probable que pase una gran parte de su día filtrando, purificando y concentrando su proteína. Estos pasos son un desafío porque la proteína puede degradarse, precipitarse o perderse en cualquier paso durante un protocolo de purificación de varios días. Seleccionar las herramientas adecuadas puede mejorar su eficiencia y disminuir la posibilidad de pérdida de proteínas.
Cada paso de su protocolo puede reducir su producción de proteínas:
La degradación de proteínas durante la lisis celular. Puede llevar horas lisar sus células y aclarar el sobrenadante, por lo que su proteína está expuesta a proteasas que pueden truncarla o degradarla por completo.
El secado durante la concentración. Después de un paso de purificación exitoso, la concentración puede parecer trivial. Pero en ausencia de precauciones incorporadas, es posible que pierda su proteína en el concentrador de proteínas al hacer girar la muestra demasiado rápido o durante demasiado tiempo.
Las fugas durante la diálisis. Durante la diálisis prolongada de varios pasos, su proteína podría filtrarse de la bolsa o casete de diálisis. Incluso si el casete está completamente intacto, su proteína puede desplegarse, replegarse, agregarse o sufrir proteólisis, especialmente en un protocolo de varios días. Es especialmente frustrante perder proteínas en esta etapa final.
Soluciones para mantener su proteína intacta y su purificación rápida:
Nota de Aplicación
Los Productos de ultrafiltración de Sartorius en la preparación de nanoportadores biológicos y médicos: una breve reseña
Trabajar con proteínas secretadas le permite evitar el complicado proceso de lisis. Además, su proteína nunca encuentra proteasas intracelulares durante la purificación. Independientemente de si su proteína se secreta naturalmente o si ha optimizado su proteína intracelular para permitir la purificación en HEK Freestyle u otra línea celular optimizada, con una proteína secretada, se enfrenta a un conjunto diferente de desafíos. Por ejemplo, las células intactas deben separarse de un volumen relativamente grande de sobrenadante y la muestra de proteína debe concentrarse.
Purificando proteínas secretadas
Si cultiva células para la producción de proteínas secretadas, gran parte de su proceso es purificar y concentrar su proteína. Para acortar sus largos días de purificación de proteínas, ofrecemos un kit que le permite aclarar el sobrenadante del cultivo celular en un solo paso. Este innovador kit simplifica el proceso de purificación de proteínas al eliminar por completo los pasos de centrifugación y reducir el tiempo para clarificar el sobrenadante de horas a minutos.
Herramientas para aislar rápidamente el sobrenadante con su proteína secretada:
Sistema de clarificación de cultivos celulares de laboratorio Sartoclear Dynamics
Confíe en su equipo al recolectar el sobrenadante de cultivo celular
Descubra por qué el científico de la IBA, Dennis Karthaus del Departamento de Ensayos y Productos de Proteínas confía en Sartoclear Dynamics Lab para ahorrar tiempo y dinero al recolectar sobrenadantes de cultivos celulares.
Nota de Aplicación
De cultivos de células de mamíferos a proteínas puras: Sartoclear Dynamics® Lab reduce significativamente el tiempo de cosecha de células
Nota de Aplicación
Aclaración a escala de laboratorio de cultivos en suspensión de mamíferos utilizando kits de laboratorio Sartoclear Dynamics® Lab V
Obtenga información celular de forma precisa y rápida. Si su objetivo es proporcionar información fisiológicamente relevante sobre sus células con una variabilidad reducida, necesita las herramientas de análisis e imágenes adecuadas. Las mejores herramientas brindan análisis reproducibles y ricos en información para ayudarlo a obtener conocimientos rápidamente y publicar sus resultados de manera rentable o avanzar con ensayos adicionales.
Tecnología para el análisis de células vivas
Proliferación celular
La proliferación es un mecanismo esencial para el desarrollo, la regeneración y la renovación normales de los tejidos. Los tres tipos principales de ensayos de proliferación celular bioquímica se basan en la síntesis de ADN, la actividad metabólica y la concentración de ATP, y suelen ser ensayos secuenciales de un solo punto final acoplados para generar datos de evolución temporal. Estas mediciones de punto final son indirectas y están sujetas a artefactos que no pueden verificarse fácilmente mediante cambios morfológicos.
Las imágenes de células vivas permiten la medición continua de los ensayos de proliferación celular directamente dentro de su incubadora, como las mediciones de confluencia sin etiquetas y el recuento directo de células mediante etiquetado fluorescente.
Apoptosis
La apoptosis es un proceso esencial para el desarrollo normal del tejido y la homeostasis, en el que las células experimentan una muerte celular programada oportuna. Los ensayos comunes para la apoptosis incluyen ensayos enzimáticos para medir la activación de caspasa-3/7 o la externalización de PS utilizando lectores de placas o citómetros de flujo. Estos ensayos comunes producen una única medición de punto final definida por el usuario, requieren múltiples pasos de lavado o levantamiento de células que pueden resultar en artefactos y no son susceptibles de mediciones a largo plazo debido al aumento de la señal de fondo con el tiempo.
El análisis de células vivas utiliza reactivos especializados para medir múltiples vías apoptóticas tanto simultáneamente como en tiempo real. Las señales apoptóticas pueden correlacionarse luego con imágenes de contraste de fase para proporcionar información biológica adicional y validación morfológica de la muerte celular apoptótica.
Cytotoxicity
La citotoxicidad es un término general que describe los efectos perjudiciales de las sustancias o los cambios ambientales sobre la salud celular que pueden comprometer la actividad metabólica, inhibir el crecimiento o la división celular o, en última instancia, causar la muerte celular.
Varios ensayos de citotoxicidad implican la medición de la integridad de la membrana celular, ya sea con tintes (a los que las células sanas son impermeables) o mediante la liberación de marcadores de las células moribundas. Las mediciones de la actividad metabólica también se utilizan para medir la citotoxicidad celular. Sin embargo, pocos de estos ensayos implican el recuento directo de células moribundas a lo largo del tiempo.
El análisis de células vivas puede dilucidar las vías citotóxicas basadas en la integridad de la membrana celular en tiempo real. Los núcleos de las células moribundas absorben un tinte inerte excluido de las células vivas, y las células moribundas se identifican con el tiempo mediante un aumento de la señal fluorescente. Las señales citotóxicas pueden correlacionarse luego con imágenes de contraste de fase para proporcionar una validación morfológica adicional de la muerte celular.
Imágenes y análisis de células vivas de alto rendimiento. Las mediciones de la salud celular, como la proliferación, la apoptosis y la citotoxicidad, son esenciales cuando se estudian los efectos de los compuestos candidatos en el crecimiento y la viabilidad celular, lo que le permite clasificar los compuestos candidatos, identificar compuestos fuera del objetivo y ayudar a determinar el mecanismo de acción. El análisis de células vivas en tiempo real tiene ventajas considerables sobre los ensayos de punto final al evaluar candidatos a fármacos. Por ejemplo, utilizando análisis de células vivas en tiempo real, es posible determinar la concentración efectiva de un compuesto candidato y el tiempo necesario para perturbar el objetivo en un solo ensayo, lo que le permite acelerar su proceso de selección de candidatos.
Con el análisis de células vivas en tiempo real, las imágenes de cultivos celulares en placas de 96 o 384 pocillos se pueden adquirir y analizar automáticamente para generar ciclos de tiempo y ver respuestas dependientes de la concentración para calcular las CE50 o IC50.
Tecnología para el análisis de células vivas
Control de calidad del cultivo celular
La variabilidad en los flujos de trabajo de su cultivo celular puede afectar negativamente la consistencia y reproducibilidad posteriores de su programa de desarrollo de fármacos. El análisis de células vivas en tiempo real le permite monitorear sus células sin la necesidad de sacarlas de la incubadora, automatizando así la captura de datos y la evaluación celular. Las células se controlan en intervalos precisos y los datos objetivos basados en imágenes pueden archivarse para compararlos con el crecimiento celular actual meses o años después.
Nota de Aplicación
Ensayo de control de calidad del cultivo celular
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