Retrovirus

Atendendo às suas necessidades de teste de retrovírus

Os retrovírus são uma família de vírus com um ciclo de vida extremamente complicado. Eles são particularmente preocupantes porque estão freqüentemente presentes em uma forma endógena como um pró-vírus em muitas, senão em todas as linhas de células de produção. As células CHO, por exemplo, possuem um vírus endógeno que é capaz de gerar uma partícula viral visível por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Isso não é infeccioso, mas algumas linhas de células de camundongos, como NS0, irão produzir um retrovírus infeccioso.

As Diretrizes do Conselho Internacional de Harmonização de Requisitos Técnicos para Produtos Farmacêuticos para Uso Humano (ICH) (Seção 3.2.1) descrevem testes para retrovírus que são aplicados a três estágios do processo de fabricação: o banco de células mestre (MCB), o fim da produção (EOP) bancos de células e a colheita a granel. Os testes descritos nas diretrizes incluem ensaios de infectividade em culturas de células sensíveis e estudos TEM. Testes adicionais são necessários apenas se um retrovírus infeccioso não for detectado e nenhum retrovírus ou partículas semelhantes a retrovírus foram observados por TEM. Nesse caso, deve ser usado um ensaio para a detecção da transcriptase reversa retroviral.

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Nossos ensaios compatíveis com GMP estão de acordo com as diretrizes da Farmacopéia Europeia (EP) e da Farmacopéia dos Estados Unidos (USP)

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As recomendações de teste dependem da espécie da linha celular que está sendo usada para fabricar o produto. As linhas celulares não conhecidas por conterem retrovírus endógenos (linhagens de células humanas ou primatas) normalmente devem mostrar resultados negativos de TEM e de transcriptase reversa aprimorada pelo produto (PERT). As linhas celulares conhecidas por conterem retrovírus endógenos (linhas de células de hamster) devem mostrar resultados positivos de TEM e resultados negativos de um ensaio de infecciosidade baseado em células. As recomendações de teste também dependem do uso pretendido do produto (por exemplo, produção de proteína recombinante, produção de vacina, vacina viral, terapia gênica de vetor viral).

As partículas semelhantes a vírus (VLP) podem estar presentes, mas não devem ser infecciosas.


Amostrado de

Transmissão de Elétron 
Microscopia (TEM) 

Produto EnhancedReverse
Transcriptase (PERT) 

Ensaio S + L Estendido


Banco de células de pesquisa

Master Cell Bank 

X* 

Banco de células de trabalho

-

X*

Fim do Banco de Células de Produção

X* 


Estoque de sementes de vírus mestre

Estoque de sementes de vírus em funcionamento

Colheita a granel não purificada

X* 

Substância droga

Produto medicamentoso

X * - somente linhas celulares de base murina (por exemplo, - hamster)

Exame de 200 perfis de células

Neste teste, usado principalmente para bancos de células de mamíferos, pelo menos 200 perfis de células medianas (células com núcleos) são rastreados para TEM. As partes principais das células - núcleo celular, organelas celulares, corpos de Golgi e a membrana plasmática - são examinadas de perto. Este ensaio verifica se a morfologia da célula permanece intacta. Ele também identifica quaisquer vírus, partículas semelhantes a vírus, fungos, leveduras, bactérias e micoplasmas, e registra a porcentagem de perfis celulares aos quais estão associados. Para retrovírus identificados, o tipo de partícula viral é registrado. Este ensaio fornece dados quantitativos e qualitativos para o produto, acompanhados por um visual TEM para submissões.

Seção Fina

Outro método empregado, principalmente para preparações de colheita a granel, é a microscopia eletrônica de seção delgada. Secções ultrafinas do material de teste são preparadas usando uma faca de diamante e micrótomo e, em seguida, coradas com acetato de uranila e citrato de chumbo. As partículas virais são contadas a partir de 10 quadrados de grade aleatórios e o título é calculado.

Coloração Negativa

A coloração negativa permite um estudo TEM de alta ampliação de espécimes biológicos para determinar a morfologia e a ultraestrutura. Um corante opaco de elétron é aplicado diretamente a amostras biológicas de fluidos em suspensão. A mancha envolve e penetra na amostra, criando contraste entre o material biológico e seu fundo. A amostra é misturada com uma concentração conhecida de grânulos de látex como referência, o que torna possível gerar um título de partículas semelhantes a vírus para a amostra.

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Os ensaios da Transcriptase Reversa Aprimorada por Produto Fluorescente (FPERT) são testes altamente sensíveis que medem a atividade da transcriptase reversa, uma enzima que transcreve o DNA do RNA e está presente em todos os retrovírus.

Como um método baseado em qPCR, os resultados podem ser gerados mais rapidamente do que os métodos TEM e baseados em células.

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O Ensaio S + L estendido é um teste limite para a presença de retrovírus infeccioso em amostras de banco de células MCB, WCB ou EoP onde a detecção de retrovírus murinos infecciosos é necessária (principalmente para teste de bancos de células CHO ou bancos de células murinas).

As células Mus dunni podem suportar a infecção de todas as quatro classes de vírus da leucemia murina (MLVs), com exceção do Moloney MLV. Usando linhas de células terminais MiCl1 e PG4, este ensaio é capaz de detectar uma variedade de retrovírus murinos infecciosos xenotrópicos e anfotrópicos.

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