Teste de estabilidade genética
Análise de estabilidade genética: caracterização e teste de estabilidade
A estabilidade genética é uma caracterização específica das células utilizadas na produção de um biológico. As células geneticamente modificadas contêm sequências de inserção do transgene que codificam a proteína de interesse. Os transgenes têm potencial de mutação, o que pode impactar na qualidade do produto ou na execução adequada dos processos.
As Diretrizes da ICH afirmam que a estabilidade e integridade da sequência de inserção precisam ser caracterizadas para garantir a produção estável da proteína correta. Esta é apenas uma das etapas necessárias para garantir que a linha celular e o sistema de produção sejam aceitáveis.
Existem várias técnicas para determinar a estabilidade genética de uma linha celular. Esses testes ocorrem durante a caracterização de uma linha de células em produção e para avaliar a estabilidade genética do Banco de Células Mestre e do Banco de Células em Fim de Produção. O teste também pode ser realizado em outros momentos, mas é particularmente útil durante as fases em que há alterações no processo de fermentação.
A Sartorius oferece os seguintes ensaios de estabilidade genética e pode aconselhar sobre a abordagem mais adequada para o seu produto:
- Teste de identidade de linha celular (código de barras de DNA, RAPD)
- Número da cópia do gene
- Sequenciamento do transgene
- Southern Blot
A equipe Sartorius ajudará a orientar através dos regulamentos para o ensaio mais adequado para sua aplicação
Nossos especialistas podem ajudar a desenvolver ensaios de sequenciamento genético personalizados para testar a estabilidade de seu produto usando nossa abordagem de plataforma
Nossos ensaios compatíveis com GMP estão de acordo com as diretrizes da Farmacopeia Europeia (EP) e da Farmacopeia dos Estados Unidos (USP)
Soluções Sartorius para análise de estabilidade genética
Soluções Sartorius para Estabilidade Genética e Caracterização | Propósito |
|---|---|
Ensaio de código de barras de DNAy | Usando informações de algumas regiões gênicas, esse código de barras pode confirmar a identidade da linha celular no nível da espécie. |
Análise de DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD) | RAPD identifica mutações ou células contaminantes e é normalmente usado para comparar bancos de células de pesquisa, mestre, trabalho ou fim de produção. |
Número da cópia do gene | Realizado em bancos de células recombinantes para confirmar o número de cópias do transgene por célula. |
Sequenciamento Sanger usando a plataforma ABI 3500 | Confirmação da estabilidade da linha celular com base na sequência de ácido nucleico do transgene usado para produzir a proteína de interesse e a região flanqueadora. |
Análise Southern blot | Southern blots identificam a presença do transgene em uma digestão do DNA celular de produção, demonstrando sua integridade. |
Teste de identidade de linha celular
A Sartorius oferece dois métodos para confirmar a identidade da linha celular:
- Ensaio de DNA barcoding
- Análise de DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD)
Ensaio de código de barras de DNA para identidade de linha celular
A Sartorius oferece códigos de barras de DNA para testes de caracterização de linha de células cGMP, onde a identidade em nível de espécie para linhas de células derivadas de mamíferos pode ser determinada de acordo com as diretrizes regulatórias ICH e CBER / FDA. Um método testado e comprovado, já conhecido e confiável pelas autoridades regulatórias, o DNA Barcoding é agora considerado o método preferido para a determinação de espécies.
O ensaio de código de barras Sartorius DNA foi validado para as seguintes linhas de células; HeLa, HEK-293, MRC-5, CHO-K1, Vero, A9, MA104 e MDBK.
Análise de DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD)
Um método alternativo de teste de identidade de linha celular para o ensaio de código de barras de DNA é a análise Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). Neste procedimento, 6 conjuntos de primers diferentes são usados para amplificar regiões do genoma alvo.
Sequenciamento Sanger
Determinar a sequência de ácido nucleico do transgene usado para produzir a proteína de interesse é um dos testes críticos realizados para determinar a estabilidade genética da linha celular.
Durante os estágios iniciais do desenvolvimento de uma droga de proteína recombinante, a sequência de RNA mensageiro (mRNA) do transgene é determinada tanto para o Banco de Células Mestre (MCB) quanto para o Banco de Células de Fim de Produção (EOP). Isso revela evidências que confirmam que não há alterações no código genético e as células não sofreram alterações significativas.
Além da região de codificação, a região de flanqueamento do transgene também é uma consideração importante, pois pode afetar os níveis de produtividade e expressão. O sequenciamento da região flanqueadora (no nível do DNA) é recomendado pelas diretrizes do ICH e deve ser considerado antes dos ensaios clínicos de fase 3.
A Sartorius usa a plataforma ABI 3500 para o sequenciamento Sanger tradicional com base em mais de 25 anos de experiência em sequenciamento de ácido nucleico com uma ampla gama de diferentes organismos e tipos de amostra, incluindo proteínas recombinantes de células humanas e CHO.
Os serviços de sequenciamento incluem:
- Sequenciamento de alta capacidade
- Re-sequenciamento de genes e / ou regiões genômicas
- Sequenciamento de leitura única / múltipla
- Desenho de primer
- Amplificação e / ou purificação por PCR
Southern Blot
Como um dos métodos mais antigos de análise de DNA, o Southern Blot oferece um resumo de uma amostra de DNA separada por eletroforese em gel com base no tamanho dos fragmentos gerados. As regiões alvo de DNA específicas são então identificadas usando uma sonda de ácido nucleico.
O teste Southern Blot identifica a presença do transgene em um resumo da produção de DNA celular. Nos casos em que há várias cópias do transgene em uma linha de células de produção, o Southern Blot identificará cada sequência alvo conforme elas são dispersas ao longo do genoma ou produzirá uma banda mais intensa onde mais de uma sequência de inserção estão posicionadas adjacentes uma à outra .
Isso permite que o Southern Blot revele informações aproximadas sobre o número de cópias do transgene e as amostras de bancos de células mestras e bancos de células em fim de produção podem ser comparadas no mesmo blot para demonstrar similaridade.
Número da cópia do gene
A identificação do número de cópias do transgene é considerada um indicador de estabilidade crítico para a produtividade em CHO e outras linhas de células usadas na produção de proteína recombinante.
As linhas de células que mantêm níveis consistentes de produtividade têm um número de cópias do transgene constante, enquanto as linhas de células que exibem uma perda de produtividade demonstraram desvio com a passagem. A PCR quantitativa é o método de escolha para determinar o número de cópias de um clone. A Sartorius oferece um serviço completo, desde o projeto e validação do ensaio até a qualificação da amostra.
