Cromatografia de Modo Misto

Introdução

O sorvente HA Ultrogel^® é um sorvente composto de hidroxiapatita-agarose para a separação de biomoléculas da escala de pesquisa e desenvolvimento até a fabricação.

A cromatografia de hidroxiapatita é considerada uma cromatografia de "pseudo-afinidade" ou troca iônica de "modo misto". Ele provou ser um mecanismo de purificação eficaz em uma variedade de processos, fornecendo seletividade de biomoléculas complementar às técnicas mais tradicionais de troca iônica ou de interação hidrofóbica.

O sorvente de hidroxiapatita HA Ultrogel é composto por esferas de agarose reticuladas com microcristais de hidroxiapatita retidos na malha de agarose. O tamanho das partículas varia entre 60 e 180 µm. A porosidade do HA Ultrogel é comparável a um gel de agarose, com um limite de exclusão para proteínas globulares de 5.000 kDa. Essa macroporosidade evita qualquer efeito de peneiração molecular durante a separação.
O sorvente é enviado em NaCl 1 M contendo 20% de etanol e está disponível em vários tamanhos de embalagem. Embalagens especiais para atender a requisitos específicos de fabricação estão disponíveis mediante solicitação.    

Características

• Mecanismo exclusivo de seletividade e separação
• Purificação de proteínas em condições neutras e não desnaturantes
• Balança de laboratório para colunas de produção em larga escala

A cromatografia de hidroxiapatita fornece um mecanismo de separação de pH neutro e suave, diferente de outros métodos convencionais, como troca iônica ou afinidade. A aplicação mais conhecida da hidroxiapatita é a separação de proteínas básicas (citocromo c, lisozima, etc.) e fosfoproteínas.

O sorvente HA Ultrogel pode ser utilizado para a separação de proteínas séricas humanas e proteínas vegetais, como lectinas, glicoproteínas, glicosidases, fosfolipidases, sulfoidrolases, esfingomielinases, transferases, trealases e quinases.

Como sorvente contendo fosfato, o HA Ultrogel pode ser utilizado para a separação de proteínas e enzimas dependentes de fosfato, bem como enzimas dependentes de DNA.

Outras aplicações chave incluem:

• Processos de purificação de vacinas (por exemplo, toxina de Bordetella pertussis)
• Remoção de agregados na purificação de anticorpos
• Separação de isoformas proteicas
• Remoção de impurezas durante a purificação de proteínas recombinantes
• Separação de fosfoproteínas, enzimas, glicoproteínas, EPO, receptores

Principais propriedades do sorvente HA Ultrogel

* Determinado usando 5 mg / mL de citocromo c diluído 50/50 em tampão de fosfato de sódio 10 mM, pH 6,9, a 30 cm / h
** Determinado usando BSA 1mg / mL diluído 50/50 em tampão de fosfato de sódio 10mM, pH 6,9, a 12,5 cm / h

Estabilidade química

O sorvente HA Ultrogel é estável em condições alcalinas e pode ser tratado com hidróxido de sódio 0,1 M para regeneração e limpeza no local. HA Ultrogel não deve ser tratado com soluções ácidas de pH <4 que dissolvem os cristais de hidroxiapatita.

Estabilidade Mecânica

As taxas de fluxo recomendadas para serem usadas com o sorvente HA Ultrogel dependem da geometria da coluna e da fase de separação (etapas de captura, eluição ou lavagem). Na escala do processo, taxas de fluxo típicas de 30 a 200 cm / h são aplicadas atualmente com tamanhos de coluna de vários litros.

O sorvente HA Ultrogel é estável em alta temperatura (até 121 ° C). Pode ser esterilizado em autoclave sem sofrer nenhuma alteração em suas propriedades cromatográficas. No entanto, a operação deve ser realizada em condições tamponadas com pH 7 para evitar a presença de fosfato que pode precipitar. O sorvente HA Ultrogel nunca deve ser congelado.

Introdução

O sorvente CMC HyperCel é composto por uma matriz rígida de celulose que possui propriedades de fluxo compatíveis com as necessidades da produção de proteínas em escala de fabricação.

O ligando proprietário, contendo um grupo amina primária e um grupo carboxila, confere propriedades de troca catiônica e hidrofobicidade ao sorvente de cromatografia. No pH de trabalho (4 a 9), o grupo amina nunca é carregado (pKa <4). O grupo carboxila é fracamente carregado no pH de adsorção (4 a 6) para permitir a adsorção de proteínas com base na hidrofobicidade. No pH da eluição (7 a 9), o grupo carboxila é totalmente desprotonado e a eluição será baseada na repulsão de carga negativa. A flexibilidade do ligante permite a separação de proteínas com uma grande variedade de pontos isoelétricos e níveis de hidrofobicidade, e várias condições podem ser empregadas para separar moléculas alvo de contaminantes.

O sorvente está disponível em várias configurações: ScreenExpert RoboColumnsu de 200 e 600 μL para triagem inicial de resina e convenientes colunas pré-embaladas de 1 e 5 mL PRC para otimização rápida do método, triagem de seletividade ou pequenos trabalhos preparativos. O adsorvente CMM HyperCel também é fornecido como uma pasta / suspensão em NaCl 1 M contendo 20% (v / v) de etanol ou como um bolo úmido para aplicações em escala de processo. O absorvente úmido do bolo facilita a transferência do absorvente, evitando a agitação e suspensão de grandes volumes de material.

O sorvente CMC HyperCel possui uma estabilidade química que garante limpeza simples no local (CIP) e armazenamento. Para CIP padrão, recomenda-se tratamento com NaOH 0,5 a 1 M, enquanto é possível o armazenamento a longo prazo em NaOH 10 a 100 mM.

Características

• Sorvente de modo misto de troca catiônica escalonável na indústria para captura de alto desempenho e remoção de impurezas com condutividade moderada
• Desempenho superior de separação, típico de uma resina de modo misto, sem as limitações tradicionais comumente associadas a essa classe de sorventes
• Capacidade de separar proteínas com ponto isoelétrico semelhante e / ou hidrofobicidade com baixa ou alta condutividade
• Alta capacidade de ligação dinâmica em ciclos repetidos de purificação
• Alto rendimento de recuperação, baixo volume de eluição
• Regeneração fácil
• Projetado para capturar anticorpos monoclonais (MAbs), fragmentos de anticorpos Fab e proteínas recombinantes de amostras desafiadoras

Principais propriedades

¹  BSA de 4 g / L em acetato de Na 50 mM complementado com NaCl, 7 minutos de tempo de permanência
²  IgG de 5 g / L em acetato de Na 50 mM complementado com NaCl, tempo de permanência de 2 minutos
³ Ajuste de condutividade com NaCl (~ 0 a 0,5 M)
4 Determinado usando acetato de Na 50 mM, pH 5,0 na coluna de escala laboratorial de 15 mm I.D. x 200 mm de comprimento

Alta seletividade para separar proteínas com ponto isoelétrico semelhante e / ou hidrofobicidade

A capacidade de separar proteínas ácidas (por exemplo, ovalbumina) de proteínas básicas (por exemplo, MAbs), juntamente com o poder de separar proteínas hidrofóbicas (por exemplo, MAbs) de proteínas mais hidrofílicas (por exemplo, ß-lactoglobulina), ilustra a poderosa seletividade do CMM Sorvente HyperCel para uma ampla gama de moléculas.

Alta capacidade de ligação para captura de proteínas

Os sorventes de modo misto são bem conhecidos para resolver os desafios de purificação que não podem ser resolvidos por trocadores de íons, normalmente à custa de capacidade reduzida. No entanto, o sorvente CMM HyperCel demonstra desempenho de capacidade competitivo com outras tecnologias de cromatografia.

As capacidades de ligação dinâmica (DBC) para duas moléculas puras (BSA, MAb) foram testadas em duas condutividades diferentes. O DBC é superior a 60 mg / mL para ambos os casos e permanece alto, mesmo em 15 mS / cm para o MAb, o que facilita a integração do processo sem a necessidade de troca de tampão ou diluição antes do carregamento. O pH para ligação e eluição é compatível para manter a integridade do MAb.

Regeneração eficiente para uma longa vida útil

Para testar a eficiência da regeneração, o MAb foi purificado a partir de um sobrenadante de cultura de células CHO clarificado. Cinco ciclos completos de purificação foram realizados. Após cada eluição, o sorvente de cromatografia foi regenerado com NaOH 1 N (tempo de contato de 1 hora) e DBC a 10% de ruptura foi testado. O DBC permaneceu inalterado, confirmando a limpeza eficiente do sorvente.

*RoboColumn is a trademark of Repligen

Introdução

O sorvente de cromatografia de modo misto MEP HyperCel é um sorvente de cromatografia flexível projetado para captura e purificação de anticorpos e várias proteínas recombinantes de escala laboratorial a industrial. Oferece:

• Um mecanismo de separação exclusivo e seletividade para separações de proteínas
• Uma alternativa sem sal / com pouco sal à cromatografia de interação hidrofóbica (HIC)
• Captura de IgG monoclonal e policlonal e purificação intermediária (remoção de agregados, DNA e HCP)
• Economia de processo aprimorada

O sorvente MEP HyperCel traz um mecanismo específico de separação de modo misto ou multimodal, diferente dos mecanismos convencionais de troca iônica ou de afinidade, e é particularmente eficaz para substituir o HIC convencional. O sorvente MEP HyperCel oferece benefícios significativos quando usado na escala do processo; particularmente, em contraste com o HIC convencional, o sorvente MEP HyperCel não requer adição maciça de sal para promover a ligação às proteínas, resultando em simplificação das operações do processo, economia de operações da unidade (por exemplo, diafiltração ou ultrafiltração) e melhor economia do processo. Devido à sua estrutura ligante, o sorvente MEP HyperCel é seletivo para imunoglobulina. Ele pode ser usado para captura direta ou purificação intermediária de IgG de várias matérias-primas, em combinação com outros métodos convencionais, como troca catiônica, HIC ou mesmo após a captura de afinidade por proteína A para maior depuração de DNA, HCP (proteínas de células hospedeiras) e remoção de agregados .


Para proteínas "não-anticorpo" (por exemplo, proteínas recombinantes, enzimas, etc.), o sorvente MEP HyperCel também pode ser usado para captura ou etapas intermediárias em uma sequência de purificação. Quando usada na etapa de captura, a matéria-prima é normalmente carregada diretamente, sem ajustes de pH ou força iônica.


O adsorvente MEP HyperCel contribui para uma simplificação do desenvolvimento do processo, economia de operações da unidade como diafiltração ou ultrafiltração e menor descarte de resíduos; espera-se uma longa vida útil prevista devido à resistência do absorvente MEP HyperCel a métodos agressivos de limpeza no local (NaOH 0,5 a 1 M, 30 a 60 minutos de tempo de contato) - todos os fatores que contribuem para reduzir o custo de purificação.

Características e benefícios

Mecanismo de separação exclusivo e seletividade diferenciada

O mecanismo de modo misto permite a purificação de anticorpos ou outras proteínas que não podem ser facilmente alcançadas por técnicas convencionais, como troca iônica ou HIC convencional; por exemplo, jogando em diferenças de hidrofobicidade e separação de proteínas com pontos isoelétricos muito próximos.

Captura direta de imunoglobulina de uma variedade de matérias-primas

Devido à sua estrutura exclusiva de ligantes, o sorvente MEP HyperCel é seletivo para imunoglobulina. A ligação do anticorpo ocorre a pH neutro e é amplamente independente da força iônica. A concentração de amostras diluídas não é necessária (por exemplo, a captura eficiente é alcançada mesmo com matérias-primas tão diluídas quanto 50 a 100 μg de IgG / mL). Foi relatada a purificação da imunoglobulina a partir de sobrenadantes da cultura de células sem proteína e suplementada com proteína, leite transgênico, fluidos de ascite e soro. Em contraste com os sorventes de afinidade com proteína A, a capacidade de ligação de IgG ao sorvente MEP HyperCel é essencialmente independente da subclasse ou espécie. As variantes de "ligação fraca" (por exemplo, IgG1 murina ou IgG de rato) são bem retidas. O sorvente MEP HyperCel contribui para a remoção do HCP e a eliminação do vírus e fornece uma depuração de DNA em uma etapa muito eficiente dos sobrenadantes da cultura de células. Observe que a adição de Tween e Triton em matéria-prima ou tampões não é recomendada, porque esses surfactantes podem interferir na ligação da proteína ao sorvente MEP HyperCel.

Eluição de IgG em condições leves e separação de contaminantes

A IgG é tipicamente eluída na faixa de pH 5,5 a 4,0, dependendo dos pontos isoelétricos e perfis de contaminantes. Esta eluição mais suave em comparação com a afinidade com a proteína A pode contribuir para a redução da formação de agregados e melhor preservação da atividade biológica do anticorpo. Além disso, o mecanismo de eluição dependente de pH do absorvente MEP HyperCel permite uma separação de HCPs, DNA, agregados de anticorpos e erros de dobragem da IgG monomérica, com base nas diferenças de hidrofobicidade. Em alguns casos, a adição de arginina nos tampões de eluição MEP HyperCel (0,1 a 1,0 M) reduz o risco de agregação de anticorpos e evita a perda de solubilidade encontrada no pH ácido com muitos anticorpos e permite uma eluição ainda mais suave do pH (em torno de pH 7,0).

Ligação às proteínas em condições sem sal ou com pouco sal

Várias famílias de proteínas recombinantes "sem anticorpos" foram purificadas usando o sorvente MEP HyperCel. Em contraste com o HIC convencional (por exemplo, ligantes de fenil ou butil), a ligação de proteínas ao sorvente não requer a adição maciça de sal, como sulfato de amônio ou outro liotopo. Isso resulta em custos mais baixos do processo e benefícios no descarte de resíduos. O produto pode ser recuperado em tampão diluído, e as etapas de operação da unidade, como ultrafiltração ou diafiltração, são minimizadas, contribuindo para um melhor fluxo do processo e maior economia do processo.

Métodos de triagem e ampliação

As propriedades físicas e químicas do sorvente MEP HyperCel são bem adequadas para uso em laboratório, piloto e escala de processo. O sorvente MEP HyperCel é compatível com sistemas rotineiramente utilizados para cromatografia de processo de baixa ou média pressão. Para separações desafiadoras de proteínas e impurezas, é recomendável filtrar o adsorvente MEP HyperCel juntamente com os sorventes de modo misto HEA HyperCel e PPA HyperCel que transportam ligantes sintéticos alifáticos e aromáticos que fornecem seletivas cromatográficas adicionais.

Em escala de laboratório ou para desenvolvimento de métodos

É possível obter separações eficientes usando placas de filtro de 96 poços ou colunas pré-embaladas da PRC. As colunas pré-embaladas PRC de 1 e 5 mL demonstram uma alta eficiência de empacotamento (> 2500 placas / metro), podem ser conectadas diretamente aos sistemas de cromatografia de laboratório mais usados e oferecem desempenho ideal e consistente. É possível obter uma escala adicional (até 900 mL de volume de sorvente) embalando o sorvente em colunas de tubo de vidro vazias de laboratório.

Aplicações de escala piloto e de processo

O sorvente MEP HyperCel foi projetado para atender aos requisitos de escala piloto até a fabricação na purificação de proteínas e atualmente é usado em colunas de multilitros de várias centenas de litros. Protocolos de embalagem específicos e suporte técnico para embalagens de colunas em larga escala estão disponíveis. Um pacote abrangente de validação e um arquivo de suporte regulatório (RSF) também estão disponíveis para auxiliar os usuários no desenvolvimento de procedimentos de validação.

Para escala de fabricação, a Sartorius oferece uma gama completa de colunas Resolute^® de 28 cm a 2 m de diâmetro.

O sorvente MEP HyperCel é composto por uma matriz rígida de celulose à qual está ligada a 4-Mercapto-etil-piridina (4-MEP). O cordão de celulose confere alta porosidade, estabilidade química e baixa interação inespecífica. Um diâmetro médio de cordão de 80 a 100 μm permite excelentes propriedades de fluxo com baixas contrapressão na coluna, compatíveis com a produção em larga escala. O sorvente MEP HyperCel pode ser usado do laboratório para colunas de escala de produção de cem litros. O sorvente está disponível em uma variedade de configurações de embalagem, bem como em colunas PRC de 1 ml e 5 ml convenientes, projetadas para triagem de sorventes, otimização rápida de métodos e aumento de escala. O sorvente MEP HyperCel é fornecido em NaCl 1 M contendo 20% de etanol, e embalagens personalizadas estão disponíveis mediante solicitação.

Tabela 1
Principais propriedades do sorvente MEP Hypercel

Determinado usando 5 mg / mL de IgG humana em PBS, tempo de permanência de 6 minutos (taxa de fluxo de 70 cm / h).

Exemplos de aplicação

Aplicação 1 - Purificação de IgG de rato a partir de uma matéria-prima "rica em proteínas": princípio de otimização de eluição usando etapas decrescentes de pH

Uma matéria-prima rica em proteínas (IgG de rato com 15% de conteúdo de soro fetal bovino) foi selecionada para ilustrar o impacto do pH da eluição na pureza do anticorpo. Numa primeira série de experiências, a fracção de IgG foi eluída a pH 4,0; no entanto, uma ampla gama de impurezas também foi eluída em pH 4,0, incluindo uma forma truncada de cadeia leve livre (TFLC), levando a uma pureza média (cerca de 75%) da IgG alvo. Em seguida, foi realizada uma eluição da etapa de pH a pH 5,5, 5,2, 4,6, 4,0 e 3,0. Utilizando a eluição de pH 5,5, a pureza eluída de IgG foi aumentada para 95% (a fração continha 4% de TFLC e estava notavelmente livre de outras impurezas [Pista 4]). Quando o pH foi reduzido para 5,2, foi solicitada a dessorção de uma concentração aumentada de TFLC (pista 5).

Quando o pH foi reduzido para 4,6 e depois para pH 4,0 (Pistas 6 e 7), os componentes de impureza foram eluídos. Finalmente, o TFLC foi eluído a pH 3,0 (Pista 8). Com base nesses achados, a recuperação ideal do anticorpo alvo seria realizada em pH 5,5.

Cortesia de dados de J. Ford e D. Conrad, Virginia Commonwealth University

Aplicação 2 - Purificação em escala laboratorial de IgG monoclonal do fluido Ascites

O sorvente MEP HyperCel foi usado para purificar a IgG do fluido da ascite. A fim de reduzir a viscosidade, a amostra foi diluída com um volume igual de tampão de equilíbrio antes do carregamento. O cromatograma IgG era 83% puro com 79% de rendimento. A pureza da fração IgG pode ser aumentada por cromatografia de troca aniônica no sorvente DEAE Ceramic HyperD ™ F.

Aplicação 3 - Captura em uma etapa do IgG1 de camundongo monoclonal do sobrenadante da cultura de células CHO (rico em proteínas) (contendo albumina) CHO (ovário de hamster chinês)

O sorvente MEP HyperCel pode alcançar a purificação de IgG em uma etapa com níveis de pureza e rendimento semelhantes aos sorventes de proteína A, mesmo quando o CCS contém grandes quantidades de albumina como contaminante principal.

Aplicação 4 - Remoção de contaminantes (HCP e DNA) durante uma etapa de captura de MAb da cultura de células CHO no absorvente MEP HyperCel

O sorvente MEP HyperCel foi utilizado para capturar um MAb de um sobrenadante de cultura de células CHO sem proteína. Os resultados (Tabela 3 abaixo) demonstram uma remoção de DNA muito eficiente (> 4.7 Log) e uma redução de 100 vezes no HCP. O passo cromatográfico adicional utilizando cromatografia de troca iônica no sorvente de troca catiônica CM Ceramic HyperD F reduziu ainda mais o conteúdo de HCP (dados não mostrados).

Aplicação 5 - Avaliação do adsorvente MEP HyperCel como alternativa HIC para a purificação de uma proteína recombinante de E. coli: Resumo dos benefícios do processo

O sorvente MEP HyperCel foi usado como substituição de uma resina butílica em uma sequência de purificação de proteína recombinante de E. coli. Os resultados resumidos (Tabela 4 abaixo) demonstram que, usado nas etapas 2 ou 3 do processo, o sorvente MEP HyperCel poderia reduzir a quantidade de sal necessária para a ligação às proteínas, resultando em melhor capacidade e pureza e eliminando a necessidade do tempo final etapa de exclusão de tamanho de consumo necessária no processo convencional de primeira geração.

Tabela 3
Remoção de contaminantes da cultura de células CHO

Ensaio de DNA usando o kit de ensaio Quant-IT ♦ PicoGreen ♦ dsDNA (Invitrogen); Ensaio HCP utilizando o kit ELISA (Cygnus Technologies).

Tabela 4
Purificação da proteína recombinante de E. coli usando o absorvente MEP HyperCel como alternativa HIC (cromatografia de interação hidrofóbica) (substituição de um ligante butílico)

HIC = Cromatografia de Interação Hidrofóbica
SEC = Cromatografia de exclusão por tamanho

Os sorventes HEA e PPA HyperCel são sorventes de cromatografia industriais projetados para captura de proteínas e remoção de impurezas em um ambiente biofarmacêutico. Operando em um mecanismo de "modo misto", seu comportamento é baseado em uma combinação de interações eletrostáticas e hidrofóbicas das proteínas com os ligantes.

Os sorventes HEA e PPA HyperCel oferecem seletividades únicas, diferentes daquelas fornecidas por troca iônica ou HIC convencional (cromatografia de interação hidrofóbica), que podem ser rastreadas para facilitar o desenvolvimento do processo.

Por exemplo, o mecanismo de interação de modo misto pode ser explorado para obter discriminação de isoformas de proteínas, ou proteínas com pontos isoelétricos semelhantes ou muito próximos, separações que geralmente não podem ser alcançadas por métodos convencionais. A estabilidade mecânica dos sorventes permite seu uso em altas taxas de fluxo em laboratório para colunas em escala de produção.

Aproveite os benefícios dos sorventes de modo misto presentes para:

• Purificar proteínas com baixa força iônica por captura hidrofóbica direta
• Separe misturas desafiadoras com novas seletividades de ligantes
• Seja ortogonal à troca iônica ou a outras etapas da cromatografia

Os sorventes HEA e PPA HyperCel são membros da família de sorventes de modo misto de cromatografia da Sartorius, complementando o sorvente MEP HyperCel (indução de carga hidrofóbica). Os sorventes HEA e PPA HyperCel transportam ligantes sintéticos, atualmente usados em grandes colunas de até 500 L para a produção de imobilizados no sorvente HyperCel, uma matriz base mecanicamente estável atualmente usada em colunas de> 100 L para a produção de proteínas. Os ligantes incluem aminas alifáticas (HEA - hexilamina) e aromáticas (PPA - fenilpropilamina), que oferecem diferentes opções de seletividade e hidrofobicidade.

¹ Determinado usando 5 mg / mL de BSA em PBS, taxa de fluxo: 100 cm / h.

Princípios do mecanismo operacional e diretrizes gerais

(Consulte o folheto do produto para obter detalhes sobre a embalagem da coluna, tampões e recomendações.)

Ligação de proteína

A ligação às proteínas é geralmente alcançada em pH neutro (isto é, PBS, pH 7,4), principalmente por interação hidrofóbica. A ligação de proteínas muito básicas pode exigir aumento do pH (pH 9,0).

Nas concentrações de sal recomendadas para ligação, há uma ligação limitada à troca iônica. Ao contrário do HIC tradicional, a ligação ocorre com baixa força iônica, em condições "fisiológicas". Em geral, nenhuma adição de sal liotrópico ou outro é necessária; no entanto, em alguns casos, a adição de quantidades moderadas de sal (por exemplo, 0,5 M de sulfato de amônio) promove a adsorção de proteínas.

O sorvente PPA HyperCel carrega um ligante aromático e tem uma hidrofobicidade mais forte que o sorvente HEA HyperCel. A capacidade de ligação é uma função da proteína. Para modelos de proteínas como BSA, são obtidas capacidades típicas de 40 a 60 mg / mL para sorventes HEA e PPA HyperCel (PBS, pH 7,4, tampão NaCl 0,14 M, vazão de 100 cm / h). Os fatores que afetam a capacidade incluem temperatura, tempo de permanência, ponto isoelétrico, hidrofobicidade da proteína alvo e a qualidade do empacotamento da coluna. (Recomenda-se o uso de colunas pré-embaladas da PRC para triagem).

Eluição de proteína

A eluição da proteína é conduzida por repulsão de carga eletrostática, à medida que o pH é reduzido para valores abaixo do pI da proteína e abaixo do pKa do ligante. A eluição é desencadeada pela redução do pH (de 7 para 2), porque algumas proteínas podem ser eluídas sem qualquer alteração no pH apenas diminuindo a concentração de sal. Em escala de laboratório, a otimização pode ser alcançada por experimentos de eluição com gradiente de sal descendente; enquanto a eluição gradual será selecionada em escala de processo. Esta abordagem também pode servir para resolver a proteína alvo de impurezas cujas características hidrofóbicas diferem. As proteínas básicas serão dessorvidas mais cedo no gradiente de pH ou na sequência da etapa de eluição, seguidas por mais proteínas ácidas.

Ao contrário do HIC tradicional, a proteína alvo é recuperada em tampão diluído, reduzindo a necessidade de diafiltração intermediária, economizando operações da unidade e contribuindo para uma melhor economia do processo.

Os sorventes HEA e PPA HyperCel são sorventes de cromatografia industriais projetados para captura de proteínas e remoção de impurezas em um ambiente biofarmacêutico. Operando em um mecanismo de "modo misto", seu comportamento é baseado em uma combinação de interações eletrostáticas e hidrofóbicas das proteínas com os ligantes.

Os sorventes HEA e PPA HyperCel oferecem seletividades únicas, diferentes daquelas fornecidas por troca iônica ou HIC convencional (cromatografia de interação hidrofóbica), que podem ser rastreadas para facilitar o desenvolvimento do processo.

Por exemplo, o mecanismo de interação de modo misto pode ser explorado para obter discriminação de isoformas de proteínas, ou proteínas com pontos isoelétricos semelhantes ou muito próximos, separações que geralmente não podem ser alcançadas por métodos convencionais. A estabilidade mecânica dos sorventes permite seu uso em altas taxas de fluxo em laboratório para colunas em escala de produção (consulte a Figura 2 para dados de pressão versus taxa de fluxo).

Aproveite os benefícios dos sorventes de modo misto presentes para:

• Purificar proteínas com baixa força iônica por captura hidrofóbica direta
• Separe misturas desafiadoras com novas seletividades de ligantes
• Seja ortogonal à troca iônica ou a outras etapas da cromatografia

Os sorventes HEA e PPA HyperCel são membros da família de sorventes de modo misto de cromatografia da Sartorius, complementando o sorvente MEP HyperCel (indução de carga hidrofóbica). Os sorventes HEA e PPA HyperCel transportam ligantes sintéticos, atualmente usados em grandes colunas de até 500 L para a produção de imobilizados no sorvente HyperCel, uma matriz base mecanicamente estável atualmente usada em colunas de> 100 L para a produção de proteínas. Os ligantes incluem aminas alifáticas (HEA - hexilamina) e aromáticas (PPA - fenilpropilamina), que oferecem diferentes opções de seletividade e hidrofobicidade.

¹ Determinado usando 5 mg / mL de BSA em PBS, taxa de fluxo: 100 cm / h.

Princípios do mecanismo operacional e diretrizes gerais

Ligação proteica

A ligação às proteínas é geralmente alcançada em pH neutro (isto é, PBS, pH 7,4), principalmente por interação hidrofóbica. A ligação de proteínas muito básicas pode exigir pH aumentado (pH 9,0) (consulte a ligação da lisozima ao sorvente HEA HyperCel).

Nas concentrações de sal recomendadas para ligação, há uma ligação limitada à troca iônica. Ao contrário do HIC tradicional, a ligação ocorre com baixa força iônica, em condições "fisiológicas". Em geral, nenhuma adição de sal liotrópico ou outro é necessária; no entanto, em alguns casos, a adição de quantidades moderadas de sal (por exemplo, 0,5 M de sulfato de amônio) promove a adsorção de proteínas.

O sorvente PPA HyperCel carrega um ligante aromático e tem uma hidrofobicidade mais forte que o sorvente HEA HyperCel. A capacidade de ligação é uma função da proteína. Para modelos de proteínas como BSA, são obtidas capacidades típicas de 40 a 60 mg / mL para sorventes HEA e PPA HyperCel (PBS, pH 7,4, tampão NaCl 0,14 M, vazão de 100 cm / h). Os fatores que afetam a capacidade incluem temperatura, tempo de permanência, ponto isoelétrico, hidrofobicidade da proteína alvo e a qualidade do empacotamento da coluna. (Recomenda-se o uso de colunas pré-embaladas da PRC para triagem).

Eluição de proteínas

A eluição da proteína é conduzida por repulsão de carga eletrostática, à medida que o pH é reduzido para valores abaixo do pI da proteína e abaixo do pKa do ligante. A eluição é desencadeada pela redução do pH (de 7 para 2), porque algumas proteínas podem ser eluídas sem qualquer alteração no pH apenas diminuindo a concentração de sal. Em escala de laboratório, a otimização pode ser alcançada por experimentos de eluição com gradiente de sal descendente; enquanto a eluição gradual será selecionada em escala de processo. Esta abordagem também pode servir para resolver a proteína alvo de impurezas cujas características hidrofóbicas diferem. As proteínas básicas serão dessorvidas mais cedo no gradiente de pH ou na sequência da etapa de eluição, seguidas por mais proteínas ácidas.

Ao contrário do HIC tradicional, a proteína alvo é recuperada em tampão diluído, reduzindo a necessidade de diafiltração intermediária, economizando operações da unidade e contribuindo para uma melhor economia do processo.