Experiência: Purificação de Proteína e Ensaios
A preparação cuidadosa garante o sucesso experimental. Esteja você realizando experimentos de curso de tempo, analisando a expressão de proteínas ou realizando ensaios para o desenvolvimento de medicamentos, todas as suas ferramentas devem funcionar de maneira ideal para gerar dados confiáveis.
Para ajudá-lo a passar do capô para a bancada, oferecemos uma variedade de tecnologias para purificar proteínas e observar a atividade celular.
Se o propósito de sua cultura de células é a purificação de proteínas, uma grande parte do seu dia provavelmente é gasta filtrando, purificando e concentrando suas proteínas. Essas etapas são desafiadoras porque a proteína pode ser degradada, precipitada ou perdida em qualquer etapa durante um protocolo de purificação de vários dias. Selecionar as ferramentas certas pode melhorar sua eficiência e diminuir a chance de perda de proteína.
Cada etapa do seu protocolo pode reduzir o seu rendimento de proteína:
Degradação de proteínas durante a lise celular. Pode levar horas para lisar suas células e esclarecer o sobrenadante, então sua proteína é exposta a proteases que podem truncá-la ou degradá-la completamente.
Secando durante a concentração. Após uma etapa de purificação bem-sucedida, a concentração pode parecer trivial. Mas, na ausência de precauções embutidas, você pode perder sua proteína no concentrador de proteína girando sua amostra muito rápido ou por muito tempo.
Vazamento durante a diálise. Durante a longa diálise de várias etapas, sua proteína pode vazar da bolsa ou cassete de diálise. Mesmo se o cassete estiver totalmente intacto, sua proteína pode se desdobrar, redobrar, agregar ou sofrer proteólise, especialmente em um protocolo de vários dias. É especialmente frustrante perder proteína neste estágio final.
Soluções para manter sua proteína intacta e sua purificação rápida:
Nota de aplicação
Produtos de ultrafiltração da Sartorius na preparação de nanocarreadores biológicos e médicos - uma breve revisão
Trabalhar com proteínas secretadas permite evitar o processo de lise complicado. Além disso, sua proteína nunca encontra proteases intracelulares durante a purificação. Independentemente de saber se sua proteína é secretada naturalmente ou se você otimizou sua proteína intracelular para permitir a purificação em HEK Freestyle ou outra linha celular otimizada, com uma proteína secretada, você encontra um conjunto diferente de desafios. Por exemplo, as células intactas devem ser separadas de um volume relativamente grande de sobrenadante e a amostra de proteína deve ser concentrada.
Purificação de proteínas secretadas
Se você cultiva células para a produção de proteínas secretadas, grande parte do seu processo consiste na purificação e concentração de suas proteínas. Para encurtar seus longos dias de purificação de proteínas, oferecemos um kit que permite esclarecer o sobrenadante da cultura de células em uma única etapa. Este kit inovador simplifica seu processo de purificação de proteínas, eliminando totalmente as etapas de centrifugação e diminuindo o tempo para o sobrenadante clarificado de horas para minutos.
Ferramentas para isolar rapidamente o sobrenadante com sua proteína secretada:
Sistema de clarificação de cultura celular Sartoclear Dynamics Lab
Confie no seu equipamento ao coletar o sobrenadante de cultura celular
Descubra por que o cientista IBA, Dennis Karthaus do Departamento de Produtos e Ensaios de Proteínas, confia no Sartoclear Dynamics Lab para economizar tempo e dinheiro ao coletar sobrenadantes de cultura de células.
Nota de aplicação
De culturas de células de mamíferos a proteínas puras: Sartoclear Dynamics® Lab reduz significativamente o tempo de colheita de células
Nota de aplicação
Clarificação em escala de laboratório de culturas de suspensão de mamíferos usando kits Sartoclear Dynamics® Lab V
Obtenha percepções celulares com precisão e rapidez. Se seu objetivo é fornecer informações fisiologicamente relevantes sobre suas células com variabilidade reduzida, você precisa das ferramentas de imagem e análise certas. As melhores ferramentas fornecem análises reproduzíveis e ricas em informações para ajudá-lo a obter rapidamente percepções e publicar seus resultados de maneira econômica ou avançar com ensaios adicionais.
Tecnologia para análise de células vivas
Proliferação Celular
A proliferação é um mecanismo essencial para o desenvolvimento, regeneração e renovação normais do tecido. Os três tipos principais de ensaios de proliferação de células bioquímicas são baseados na síntese de DNA, atividade metabólica e concentração de ATP, e são tipicamente ensaios sequenciais de ponto final único acoplados para gerar dados de curso de tempo. Essas medições de ponto final são indiretas e sujeitas a artefatos que não podem ser verificados prontamente por mudanças morfológicas.
A imagem de células vivas permite a medição contínua de ensaios de proliferação celular dentro de sua incubadora, como medições de confluência sem rótulo e contagem direta de células usando rotulagem fluorescente.
Apoptose
A apoptose é um processo essencial para o desenvolvimento normal do tecido e homeostase, no qual as células sofrem morte celular programada em tempo hábil. Os ensaios comuns para apoptose incluem ensaios enzimáticos para medir a ativação da caspase-3/7 ou externalização de PS usando leitores de placas ou citômetros de fluxo. Esses ensaios comuns produzem uma única medição de ponto final definida pelo usuário, exigem várias etapas de lavagem ou levantamento de células que podem resultar em artefatos e não são passíveis de medições de longo prazo devido ao aumento do sinal de fundo ao longo do tempo.
A análise de células vivas usa reagentes especializados para medir múltiplas vias apoptóticas simultaneamente e em tempo real. Os sinais apoptóticos podem então ser correlacionados com imagens de contraste de fase para fornecer uma visão biológica adicional e validação morfológica da morte celular apoptótica.
Citotoxicidade
Citotoxicidade é um termo geral que descreve os efeitos prejudiciais de substâncias ou mudanças ambientais na saúde celular que podem comprometer a atividade metabólica, inibir o crescimento ou divisão celular ou, por fim, causar a morte celular.
Vários ensaios de citotoxicidade envolvem a medição da integridade da membrana celular, seja com corantes (aos quais as células saudáveis são impermeáveis) ou por meio da liberação de marcadores de células mortas. As medições da atividade metabólica também são usadas para medir a citotoxicidade celular. No entanto, poucos desses ensaios envolvem a contagem direta de células mortas ao longo do tempo.
A análise de células vivas pode elucidar as vias citotóxicas com base na integridade da membrana celular em tempo real. Os núcleos das células que morrem absorvem um corante inerte excluído das células vivas, e as células que morrem são identificadas ao longo do tempo por um aumento no sinal fluorescente. Os sinais citotóxicos podem então ser correlacionados com imagens de contraste de fase para fornecer validação morfológica adicional de morte celular.
Imagem e análise de células vivas de alto rendimento. As medições da saúde celular, como proliferação, apoptose e citotoxidade, são essenciais ao estudar os efeitos dos compostos candidatos no crescimento e na viabilidade celular, permitindo classificar os compostos candidatos, identificar compostos fora do alvo e ajudar a determinar o mecanismo de ação. A análise de células vivas em tempo real tem vantagens consideráveis sobre os ensaios de ponto final ao avaliar candidatos a drogas. Por exemplo, usando análise de células vivas em tempo real, é possível determinar a concentração efetiva de um composto candidato e o tempo necessário para perturbar o alvo em um único ensaio, permitindo que você acelere seu pipeline de triagem de candidato.
Com a análise de células vivas em tempo real, as imagens de culturas de células em placas de 96 ou 384 poços podem ser adquiridas e analisadas automaticamente para gerar cursos de tempo e ver as respostas dependentes da concentração para calcular EC50s ou IC50s.
Tecnologia para análise de células vivas
Controle de qualidade de cultura celular
A variabilidade em seus fluxos de trabalho de cultura de células pode afetar adversamente a consistência e reprodutibilidade downstream de seu programa de desenvolvimento de medicamentos. A análise de células vivas em tempo real permite monitorar suas células sem a necessidade de removê-las da incubadora, automatizando a captura de dados e a avaliação das células. As células são monitoradas em intervalos precisos, e os dados objetivos baseados em imagens podem ser arquivados para comparação com o crescimento celular atual meses ou anos depois.
