Cromatografía de modo mixto

Introducción

El sorbente HA Ultrogel® es un sorbente compuesto de hidroxiapatita agarosa para la separación de biomoléculas desde la escala de investigación y desarrollo hasta la fabricación.

La cromatografía de hidroxiapatita se considera una cromatografía de "pseudoafinidad" o intercambio iónico de "modo mixto". Ha demostrado ser un mecanismo de purificación efectivo en una variedad de procesos, proporcionando selectividad de biomolécula complementaria a las técnicas de interacción iónica o de intercambio iónico más tradicionales.

El sorbente de hidroxiapatita Ultrogel HA está compuesto de perlas de agarosa reticuladas con microcristales de hidroxiapatita atrapados en la malla de agarosa. El tamaño de partícula oscila entre 60 y 180 µm. La porosidad de HA Ultrogel es comparable a un gel de agarosa, con un límite de exclusión para proteínas globulares de 5.000 kDa. Esta macroporosidad evita cualquier efecto de tamizado molecular durante la separación.

El sorbente se envía en NaCl 1 M que contiene etanol al 20% y está disponible en una variedad de tamaños de paquete. Bajo pedido, se encuentran disponibles embalajes especiales para cumplir con los requisitos específicos de fabricación.

Caracteristicas

• Exclusivo mecanismo de selectividad y separación.
• Purificación de proteínas en condiciones neutrales, no desnaturalizantes.
• Escalas de laboratorio a columnas de producción a gran escala.

La cromatografía de hidroxiapatita proporciona un mecanismo de separación de pH suave y neutro, diferente de otros métodos convencionales como el intercambio iónico o la afinidad. La aplicación más conocida de hidroxiapatita es la separación de proteínas básicas (citocromo c, lisozima, etc.) y fosfoproteínas.

El sorbente HA Ultrogel puede usarse para la separación de proteínas séricas humanas y proteínas vegetales tales como lectinas, glicoproteínas, glicosidasas, fosfolipidasas, sulfohidrolasas, esfingomielinasas, transferasas, trehalasas y quinasas.

Como sorbente que contiene fosfato, HA Ultrogel puede usarse para la separación de proteínas y enzimas dependientes de fosfato, así como enzimas dependientes de ADN. Como sorbente que contiene fosfato, HA Ultrogel puede usarse para la separación de proteínas dependientes de fosfato y enzimas, así como enzimas dependientes de ADN.

Otras aplicaciones clave incluyen:

• Procesos de purificación de vacunas (por ejemplo, toxina de Bordetella pertussis)
• Eliminación de agregados en la purificación de anticuerpos.
• Separación de isoformas de proteínas.
• Eliminación de impurezas durante la purificación de proteínas recombinantes.
• Separación de fosfoproteínas, enzimas, glicoproteínas, EPO, receptores

Principales propiedades del sorbente Ultrogel HA

* Determinado con 5 mg / ml de citocromo c diluido 50/50 en tampón de fosfato de sodio 10 mM pH 6.9 a 30 cm / h

** Determinado con 1 mg / ml de BSA diluido 50/50 en tampón de fosfato de sodio 10 mM pH 6.9 a 12.5 cm / h

Estabilidad química

El sorbente HA Ultrogel es estable en condiciones alcalinas y puede tratarse con hidróxido de sodio 0,1 M para su regeneración y limpieza. HA Ultrogel no debe tratarse con soluciones ácidas de pH <4 que disuelvan los cristales de hidroxiapatita.

Estabilidad Mecánica

Los caudales recomendados para ser utilizados con el sorbente HA Ultrogel dependen de la geometría de la columna y de la fase de separación (pasos de captura, elución o lavado). A escala de proceso, los caudales típicos de 30 a 200 cm / h se aplican actualmente con tamaños de columna de varios litros.

El sorbente HA Ultrogel es estable a alta temperatura (hasta 121 ° C). Se puede esterilizar en autoclave sin sufrir cambios en sus propiedades cromatográficas. Sin embargo, la operación debe realizarse en condiciones amortiguadas a pH 7 para evitar la presencia de fosfato que puede precipitar. El sorbente HA Ultrogel nunca debe congelarse.

Introducción

El sorbente CMM HyperCel está compuesto por una matriz de celulosa rígida que tiene propiedades de flujo compatibles con las necesidades de producción de proteínas a escala de fabricación.

El ligando patentado, que contiene una amina primaria y un grupo carboxilo, confiere propiedades de intercambio catiónico e hidrofobicidad al sorbente de cromatografía. A pH de trabajo (4 a 9), el grupo amina nunca se carga (pKa <4). El grupo carboxilo está débilmente cargado a un pH de adsorción (4 a 6) para permitir la adsorción de proteínas en función de la hidrofobicidad. A pH de elución (7 a 9), el grupo carboxilo está completamente desprotonado y la elución se basará en la repulsión de carga negativa. La flexibilidad del ligando permite la separación de proteínas con una gran variedad de puntos isoeléctricos y niveles de hidrofobicidad, y se pueden emplear múltiples condiciones para separar las moléculas objetivo de los contaminantes.

El sorbente está disponible en una variedad de configuraciones: 200 y 600 μL de ScreenExpert RoboColumnsu para el cribado inicial de resina, y cómodas columnas preempaquetadas de PRC de 1 ml y 5 ml para una optimización rápida del método, cribado de selectividad o pequeños trabajos preparatorios. El sorbente CMM HyperCel también se suministra como suspensión / suspensión en NaCl 1 M que contiene etanol al 20% (v / v), o como una torta húmeda para aplicaciones a escala de proceso. El sorbente de torta húmedo facilita la transferencia del sorbente, evitando la agitación y la suspensión de grandes volúmenes de material.

El sorbente CMM HyperCel tiene una estabilidad química que garantiza una limpieza simple en el lugar (CIP) y almacenamiento. Para el CIP estándar, se recomienda un tratamiento de NaOH de 0,5 a 1 M, mientras que es posible el almacenamiento a largo plazo en NaOH de 10 a 100 mM.

Características

• Sorbente de intercambio mixto escalable en la industria para captura de alto rendimiento y eliminación de impurezas con conductividad salina moderada
• Rendimiento de separación superior, típico de una resina de modo mixto, sin las limitaciones tradicionales comúnmente asociadas con esta clase de sorbente
• Capacidad para separar proteínas con punto isoeléctrico y / o hidrofobicidad similares a baja o alta conductividad
• Alta capacidad de unión dinámica en ciclos de purificación repetidos.
• Alto rendimiento de recuperación, bajo volumen de elución
• Fácil regeneración
• Diseñado para capturar anticuerpos monoclonales (MAbs), fragmentos de anticuerpos Fab y proteínas recombinantes de muestras difíciles.

Propiedades principales

¹ 4 g/L BSA in 50 mM Na acetate complemented with NaCl, 7 minute residence time
² 5 g/L IgG in 50 mM Na acetate complemented with NaCl, 2 minute residence time
³ Conductivity adjustment with NaCl (~ 0 to 0.5 M)
4 Determined using 50 mM Na acetate, pH 5.0 on laboratory scale column of 15 mm I.D. x 200 mm length

Alta selectividad para separar proteínas con punto isoeléctrico y / o hidrofobicidad similares

La capacidad de separar las proteínas ácidas (p. Ej., Ovoalbúmina) de las proteínas básicas (p. Ej., MAbs), junto con el poder de separar las proteínas hidrofóbicas (p. Ej., MAbs) de las proteínas más hidrofílicas (p. Ej., Ss-lactoglobulina), ilustra la poderosa selectividad de CMM Sorbente HyperCel para una amplia gama de moléculas.

Alta capacidad de unión para la captura de proteínas.

Los sorbentes de modo mixto son bien conocidos por resolver desafíos de purificación que no pueden ser resueltos por los intercambiadores de iones, esto normalmente es a expensas de la capacidad reducida. Sin embargo, el sorbente CMM HyperCel demuestra un rendimiento de capacidad competitivo con otras tecnologías de cromatografía.

Las capacidades de unión dinámica (DBC) para dos moléculas puras (BSA, MAb) se probaron en dos conductividades diferentes. El DBC es superior a 60 mg / ml en ambos casos y permanece alto, incluso a 15 mS / cm para MAb, lo que facilita la integración del proceso sin la necesidad de intercambio o dilución de tampón antes de la carga. El pH para la unión y la elución es compatible para mantener la integridad del MAb.

Regeneración eficiente para una larga vida útil.

Para probar la eficacia de la regeneración, el MAb se purificó a partir de un sobrenadante de cultivo celular CHO clarificado. Se realizaron cinco ciclos completos de purificación. Después de cada elución, el sorbente de cromatografía se regeneró con NaOH 1 N (1 hora de contacto) y se probó DBC al 10% de avance. El DBC permaneció sin cambios, confirmando la limpieza eficiente del sorbente.

*RoboColumn is a trademark of Repligen

Introducción

El sorbente de cromatografía de modo mixto HyperCel MEP es un sorbente de cromatografía flexible diseñado para la captura y purificación de anticuerpos y diversas proteínas recombinantes desde el laboratorio hasta la escala de fabricación. Ofrece:

• Un mecanismo de separación y selectividad únicos para las separaciones de proteínas.
• Una alternativa sin sal / baja en sal a la cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)
• Captura de IgG monoclonal y policlonal y purificación intermedia (agregado, eliminación de ADN y HCP)
• Procesos económicos mejorados

El sorbente MEP HyperCel trae un mecanismo de separación específico de modo mixto o multimodal, diferente de los mecanismos convencionales de intercambio iónico o de afinidad, y es particularmente efectivo para reemplazar el HIC convencional. El sorbente MEP HyperCel proporciona beneficios significativos cuando se usa a escala de proceso; particularmente, en contraste con el HIC convencional, el sorbente HyperCel MEP no requiere la adición masiva de sal para promover la unión a proteínas, lo que resulta en la simplificación de las operaciones del proceso, el ahorro de las operaciones unitarias (por ejemplo, diafiltración o ultrafiltración) y una mejor economía del proceso. Debido a su estructura de ligando, el sorbente MEP HyperCel es selectivo de inmunoglobulina. Se puede utilizar para la captura directa o la purificación intermedia de IgG a partir de diversas materias primas en combinación con otros métodos convencionales como el intercambio de cationes, HIC, o incluso después de la captura de afinidad de la proteína A para una mayor eliminación del ADN, HCP (proteínas de la célula huésped) y eliminación de agregados .

Para las proteínas "sin anticuerpos" (p. Ej., Proteínas recombinantes, enzimas, etc.), el sorbente HyperCel MEP también se puede usar para la captura o etapas intermedias en una secuencia de purificación. Cuando se usa en la etapa de captura, la materia prima generalmente se carga directamente sin ajustes de pH o fuerza iónica.

El sorbente MEP HyperCel contribuye a una simplificación del desarrollo del proceso, al ahorro de las operaciones de la unidad, como la diafiltración o ultrafiltración, y a una menor eliminación de residuos; Se espera una larga vida útil anticipada debido a la resistencia del sorbente MEP HyperCel a los métodos de limpieza en el lugar (NaOH 0.5 a 1 M, tiempo de contacto de 30 a 60 minutos), todos factores que contribuyen a un menor costo de purificación.

Características y Beneficios

Mecanismo de separación único y selectividad diferenciada

El mecanismo de modo mixto permite la purificación de anticuerpos u otras proteínas que no se pueden lograr fácilmente mediante técnicas convencionales como el intercambio iónico o la HIC convencional; por ejemplo, jugando con diferencias en hidrofobicidad y separación de proteínas con puntos isoeléctricos muy cercanos.

Captura directa de inmunoglobulina de una variedad de materias primas

Debido a su estructura de ligando única, el sorbente MEP HyperCel es selectivo de inmunoglobulina. La unión de anticuerpos se produce a pH neutro y es en gran medida independiente de la fuerza iónica. No es necesaria la concentración de muestras diluidas (p. Ej., Se logra una captura eficiente incluso con materias primas tan diluidas como 50 a 100 μg de IgG / ml). Se ha informado de la purificación de inmunoglobulina a partir de sobrenadantes de cultivo celular sin proteínas y suplementados con proteínas, leche transgénica, fluidos ascíticos y suero. A diferencia de los sorbentes de afinidad de proteína A, la capacidad de unión de IgG en el sorbente HyperCel de MEP es esencialmente independiente de la subclase o especie. Las variantes de "unión débil" (p. Ej., IgG1 murina o IgG de rata) se retienen bien. El sorbente MEP HyperCel contribuye a la eliminación de HCP y la eliminación de virus, y proporciona una eliminación de ADN en un solo paso muy eficiente de los sobrenadantes de cultivos celulares. Tenga en cuenta que no se recomienda la adición de Tween y Triton en materia prima o tampones, ya que dichos tensioactivos pueden interferir con la unión de la proteína al sorbente HyperCel de MEP.

Elución de IgG en condiciones leves y separación de contaminantes

La IgG se eluye típicamente en el rango de pH 5.5 a 4.0, dependiendo de los puntos isoeléctricos y los perfiles de contaminantes. Esta elución más suave en comparación con la afinidad de la proteína A puede contribuir a la reducción de la formación de agregados y a una mejor preservación de la actividad biológica del anticuerpo. Además, el mecanismo de elución dependiente del pH del sorbente MEP HyperCel permite la separación de HCP, ADN, agregados de anticuerpos y pliegues erróneos de la IgG monomérica en función de las diferencias de hidrofobicidad. En algunos casos, la adición de arginina en los tampones de elución HyperCel MEP (0.1 a 1.0 M) reduce el riesgo de agregación de anticuerpos y previene la pérdida de solubilidad encontrada a pH ácido con muchos anticuerpos y permite una elución de pH aún más leve (alrededor de pH 7.0).

Unión de proteínas en condiciones sin sal o bajas en sal

Varias familias de proteínas recombinantes "no anticuerpos" se han purificado utilizando sorbente MEP HyperCel. A diferencia de los HIC convencionales (p. Ej., Ligandos de fenilo o butilo), la unión de proteínas al sorbente no requiere la adición masiva de sal, como sulfato de amonio u otro liotropo. Esto da como resultado menores costos de proceso y beneficios de eliminación de desechos. El producto puede recuperarse en tampón diluido, y los pasos de operación de la unidad, como la ultrafiltración o la diafiltración, se minimizan, lo que contribuye a un mejor flujo del proceso y una economía del proceso mejorada.

Métodos Screening y Scale Up

Las propiedades físicas y químicas del sorbente HyperCel MEP se adaptan bien al uso en laboratorio, piloto y escala de proceso. El sorbente MEP HyperCel es compatible con los sistemas utilizados habitualmente para la cromatografía de proceso de baja o media presión. Para las separaciones desafiantes de proteínas e impurezas, se recomienda seleccionar el sorbente MEP HyperCel junto con los sorbentes HEA HyperCel y PPA HyperCel de modo mixto que llevan ligandos sintéticos alifáticos y aromáticos que proporcionan selectividades cromatográficas adicionales.

A escala de laboratorio o para el desarrollo de métodos

Se pueden lograr separaciones eficientes utilizando placas de filtro de 96 pocillos o columnas preempaquetadas de PRC. Las columnas preempaquetadas de PRC de 1 ml y 5 ml demuestran una alta eficiencia de empaque (> 2500 placas / metro), se pueden conectar directamente a los sistemas de cromatografía de laboratorio de uso común y ofrecen un rendimiento óptimo y consistente. Se puede lograr una mayor ampliación (hasta 900 ml de volumen de sorbente) empacando el sorbente en columnas de tubos de vidrio vacíos de laboratorio.

Aplicaciones de escala piloto y de proceso

El sorbente MEP HyperCel ha sido diseñado para cumplir con los requisitos piloto a escala de fabricación en la purificación de proteínas, y actualmente se utiliza en columnas de volúmenes de varios litros hasta varios cientos de litros. Están disponibles protocolos específicos de empaque y soporte técnico para el empaque de columnas a gran escala. Un paquete completo de validación y un Archivo de Soporte Regulatorio (RSF) también están disponibles para ayudar a los usuarios en el desarrollo de procedimientos de validación.

For manufacturing scale, Sartorius offers a complete range of Resolute^® columns from 28 cm to 2 m diameter.

El sorbente MEP HyperCel está compuesto por una matriz de celulosa rígida patentada a la que se une la 4-mercapto-etil-piridina (4-MEP). La perla de celulosa confiere alta porosidad, estabilidad química y baja interacción no específica. Un diámetro de cordón promedio de 80 a 100 μm permite excelentes propiedades de flujo a bajas presiones de columna, compatible con la producción a gran escala. El sorbente MEP HyperCel se puede utilizar desde el laboratorio hasta columnas de escala de producción de cien litros. El sorbente está disponible en una variedad de configuraciones de empaque, así como en cómodas columnas preempaquetadas de PRC de 1 ml y 5 ml diseñadas para la detección de sorbentes, la optimización de métodos rápidos y la ampliación. El sorbente MEP HyperCel se suministra en NaCl 1 M que contiene 20% de etanol, y el embalaje personalizado está disponible a pedido.

Tabla 1
Main Properties of MEP Hypercel Sorbent

Determined using 5 mg/mL human IgG in PBS, 6 minute residence time (flow rate 70 cm/h).

Ejemplos de aplicación

Aplicación 1 - Purificación de IgG de rata a partir de una materia prima "rica en proteínas": Principio de optimización de elución utilizando pasos de pH decrecientes

Se seleccionó una materia prima rica en proteínas (IgG de rata en 15% de suero fetal bovino) para ilustrar el impacto del pH de elución sobre la pureza del anticuerpo. En una primera serie de experimentos, la fracción de IgG se eluyó a pH 4.0; sin embargo, también se eluyó una amplia gama de impurezas a pH 4.0, incluida una forma truncada de cadena ligera libre (TFLC), que condujo a una pureza media (alrededor del 75%) de la IgG objetivo. Luego, se realizó una elución por pasos de pH a pH 5.5, 5.2, 4.6, 4.0 y 3.0. Usando una elución de pH 5.5, la pureza eluida de IgG se incrementó al 95% (la fracción contenía 4% de TFLC y estaba notablemente libre de otras impurezas [Carril 4]). Cuando el pH se redujo a 5.2, se provocó la desorción de una mayor concentración de TFLC (Carril 5).

Cuando el pH se redujo a 4,6 y luego a pH 4,0 (carriles 6 y 7), se eluyeron los componentes de impureza. Finalmente, TFLC se eluyó a pH 3,0 (Carril 8). En base a estos hallazgos, la recuperación óptima del anticuerpo objetivo se llevaría a cabo a pH 5.5.

Data Courtesy of J. Ford and D. Conrad, Virginia Commonwealth University

Aplicación 2 - Purificación a escala de laboratorio de IgG monoclonal a partir de fluido de ascitis

El sorbente MEP HyperCel se utilizó para purificar la IgG del líquido ascítico. Para reducir la viscosidad, la muestra se diluyó con un volumen igual de tampón de equilibrio antes de la carga. El cromatograma, IgG fue 83% puro con 79% de rendimiento. La pureza de la fracción de IgG podría aumentarse mediante cromatografía de intercambio aniónico en sorbente DEAE Ceramic HyperD ™ F.

Aplicación 3 - Captura en un solo paso de IgG1 monoclonal de ratón del sobrenadante de cultivo celular (CCS) "rico en proteínas" (que contiene albúmina) CHO (ovario de hámster chino)

El sorbente MEP HyperCel puede lograr la purificación de IgG en un solo paso con niveles similares de pureza y rendimiento que los sorbentes de proteína A, incluso cuando el CCS contiene altas cantidades de albúmina como contaminante principal.

Aplicación 4: eliminación de contaminantes (HCP y ADN) durante un paso de captura de MAb del cultivo de células CHO en sorbente HyperCel MEP

El sorbente MEP HyperCel se usó para capturar un MAb de un sobrenadante de cultivo celular CHO libre de proteínas. Los resultados (Tabla 3 a continuación) demuestran una eliminación de ADN muy eficiente (> 4.7 Log) y una reducción de 100 veces en HCP. El paso cromatográfico adicional usando cromatografía de intercambio iónico en sorbente de intercambio catiónico CM Ceramic HyperD F redujo aún más el contenido de HCP (datos no mostrados).

Aplicación 5 - Evaluación del sorbente HyperCel MEP como alternativa HIC para la purificación de una proteína recombinante de E. coli: resumen de los beneficios del proceso

El sorbente MEP HyperCel se utilizó como reemplazo de una resina de butilo en una secuencia de purificación de proteína recombinante de E. coli. Los resultados resumidos (Tabla 4 a continuación) demuestran que el sorbente MEP HyperCel utilizado en el paso 2 o el paso 3 del proceso podría reducir la cantidad de sal requerida para la unión a proteínas, resultó en una mejor capacidad y pureza, y eliminó la necesidad del tiempo final -paso de exclusión de tamaño de consumo necesario en el proceso convencional de primera generación.

Tabla 3
Eliminación de contaminantes del cultivo celular CHO

DNA assay using Quant-IT^♦ PicoGreen^♦ dsDNA assay kit (Invitrogen); HCP assay using ELISA kit (Cygnus Technologies).

Tabla 4
Purificación de la proteína recombinante de E. coli utilizando sorbente HyperCel MEP como alternativa HIC (cromatografía de interacción hidrófoba) (reemplazo de un ligando butílico)

HIC = Hydrophobic Interaction Chromatography
SEC = Size Exclusion Chromatography

Los sorbentes HEA y PPA HyperCel son sorbentes de cromatografía escalables por la industria diseñados para la captura de proteínas y la eliminación de impurezas en un entorno biofarmacéutico. Operando en un mecanismo de "modo mixto", su comportamiento se basa en una combinación de interacciones electrostáticas e hidrófobas de las proteínas con los ligandos.

Los sorbentes HEA y PPA HyperCel proporcionan selectividades únicas, diferentes de las dadas por intercambio iónico o HIC convencional (cromatografía de interacción hidrofóbica), que pueden seleccionarse para facilitar el desarrollo del proceso.

Por ejemplo, el mecanismo de interacción de modo mixto puede explotarse para lograr la discriminación de proteínas isoformas, o proteínas que tienen puntos isoeléctricos similares o muy cercanos, separaciones que generalmente no se pueden lograr por métodos convencionales. La estabilidad mecánica de los sorbentes permite su uso a altos caudales en columnas de laboratorio a escala de producción.

Aproveche los beneficios de los sorbentes de modo mixto presentes para:

• Purifique proteínas a baja fuerza iónica mediante captura directa hidrófoba
• Separe mezclas desafiantes con nuevas selectividades de ligando
• Ser ortogonal al intercambio iónico u otros pasos de cromatografía.

Los sorbentes HEA y PPA HyperCel son miembros de la familia de sorbentes de cromatografía de modo mixto Sartorius, que complementan el sorbente HyperCel MEP (inducción de carga hidrofóbica). Los sorbentes HEA y PPA HyperCel llevan ligandos sintéticos, actualmente utilizados en columnas grandes de hasta 500 L para la producción de sorbente inmovilizado en HyperCel, una matriz base mecánicamente estable utilizada actualmente en columnas de> 100 L para la producción de proteínas. Los ligandos incluyen aminas alifáticas (HEA - hexilamina) y aromáticas (PPA - fenilpropilamina), que ofrecen diferentes opciones de selectividad e hidrofobicidad.

¹Determined using 5 mg/mL BSA in PBS, flow rate: 100 cm/h.

Principios del mecanismo operativo y directrices generales

(Consulte el prospecto del producto para obtener detalles sobre el embalaje de la columna, los tampones y las recomendaciones)

Enlace proteico

La unión a proteínas generalmente se logra a pH neutro (es decir, PBS, pH 7,4), principalmente por interacción hidrófoba. La unión de proteínas muy básicas puede requerir un aumento del pH (pH 9.0).

A las concentraciones de sal recomendadas para la unión, existe una unión limitada de intercambio iónico. A diferencia de la HIC tradicional, la unión se produce con baja fuerza iónica, en condiciones "fisiológicas". En general, no se requiere la adición de sal liotrópica u otra; sin embargo, en algunos casos, la adición de cantidades moderadas de sal (por ejemplo, sulfato de amonio 0,5 M) promueve la adsorción de proteínas.

El sorbente PPA HyperCel lleva un ligando aromático y tiene una hidrofobicidad más fuerte que el sorbente HEA HyperCel. La capacidad de unión es una función de la proteína. Para modelos de proteínas como BSA, se obtienen capacidades típicas de 40 a 60 mg / ml para sorbentes HEA y PPA HyperCel (PBS, pH 7,4, tampón de NaCl 0,14 M, velocidad de flujo de 100 cm / h). Los factores que afectan la capacidad incluyen la temperatura, el tiempo de residencia, el punto isoeléctrico, la hidrofobicidad de la proteína objetivo y la calidad del empaque de la columna. (Se recomienda el uso de columnas preempaquetadas de PRC para la detección).

Elución proteica

La elución de proteínas es impulsada por la repulsión de carga electrostática, ya que el pH se reduce a valores por debajo del pI de la proteína y por debajo del pKa del ligando. La elución se desencadena al reducir el pH (de 7 a 2) porque algunas proteínas pueden eluirse sin ningún cambio en el pH simplemente disminuyendo la concentración de sal. A escala de laboratorio, la optimización se puede lograr mediante experimentos de elución de gradiente de sal descendente; mientras que la elución gradual se seleccionará a escala de proceso. Este enfoque también puede servir para resolver la proteína objetivo a partir de impurezas cuyas características hidrofóbicas difieren. Las proteínas básicas se desorberán antes en el gradiente de pH o en la secuencia de elución por pasos, seguidas de más proteínas ácidas.

A diferencia de la HIC tradicional, la proteína objetivo se recupera en tampón diluido, lo que reduce la necesidad de diafiltración intermedia, ahorra operaciones de la unidad y contribuye a una mejor economía del proceso.

Los sorbentes HEA y PPA HyperCel son sorbentes de cromatografía escalables por la industria diseñados para la captura de proteínas y la eliminación de impurezas en un entorno biofarmacéutico. Operando en un mecanismo de "modo mixto", su comportamiento se basa en una combinación de interacciones electrostáticas e hidrófobas de las proteínas con los ligandos.

Los sorbentes HEA y PPA HyperCel proporcionan selectividades únicas, diferentes de las dadas por intercambio iónico o HIC convencional (cromatografía de interacción hidrofóbica), que pueden seleccionarse para facilitar el desarrollo del proceso.

Por ejemplo, el mecanismo de interacción de modo mixto puede explotarse para lograr la discriminación de proteínas isoformas, o proteínas que tienen puntos isoeléctricos similares o muy cercanos, separaciones que generalmente no se pueden lograr por métodos convencionales. La estabilidad mecánica de los sorbentes permite su uso a altas velocidades de flujo en columnas de laboratorio a escala de producción (consulte la Figura 2 para obtener información sobre la presión frente a la velocidad de flujo).

Aproveche los beneficios de los sorbentes de modo mixto presentes para:

• Purifique proteínas a baja fuerza iónica mediante captura directa hidrófoba
• Separe mezclas desafiantes con nuevas selectividades de ligando
• Ser ortogonal al intercambio iónico u otros pasos de cromatografía.

Los sorbentes HEA y PPA HyperCel son miembros de la familia de sorbentes de cromatografía de modo mixto Sartorius, que complementan el sorbente HyperCel MEP (inducción de carga hidrofóbica). Los sorbentes HEA y PPA HyperCel llevan ligandos sintéticos, actualmente utilizados en columnas grandes de hasta 500 L para la producción de sorbente inmovilizado en HyperCel, una matriz base mecánicamente estable utilizada actualmente en columnas de> 100 L para la producción de proteínas. Los ligandos incluyen aminas alifáticas (HEA - hexilamina) y aromáticas (PPA - fenilpropilamina), que ofrecen diferentes opciones de selectividad e hidrofobicidad.

¹Determined using 5 mg/mL BSA in PBS, flow rate: 100 cm/h.

Principios del mecanismo operativo y directrices generales

Enlace proteico

La unión a proteínas generalmente se logra a pH neutro (es decir, PBS, pH 7,4), principalmente por interacción hidrófoba. La unión de proteínas muy básicas puede requerir un aumento del pH (pH 9.0) (consulte la unión de la lisozima al sorbente HEA HyperCel).

A las concentraciones de sal recomendadas para la unión, existe una unión limitada de intercambio iónico. A diferencia de la HIC tradicional, la unión se produce con baja fuerza iónica, en condiciones "fisiológicas". En general, no se requiere la adición de sal liotrópica u otra; sin embargo, en algunos casos, la adición de cantidades moderadas de sal (por ejemplo, sulfato de amonio 0,5 M) promueve la adsorción de proteínas.

El sorbente PPA HyperCel lleva un ligando aromático y tiene una hidrofobicidad más fuerte que el sorbente HEA HyperCel. La capacidad de unión es una función de la proteína. Para modelos de proteínas como BSA, se obtienen capacidades típicas de 40 a 60 mg / ml para sorbentes HEA y PPA HyperCel (PBS, pH 7,4, tampón de NaCl 0,14 M, velocidad de flujo de 100 cm / h). Los factores que afectan la capacidad incluyen la temperatura, el tiempo de residencia, el punto isoeléctrico, la hidrofobicidad de la proteína objetivo y la calidad del empaque de la columna. (Se recomienda el uso de columnas preempaquetadas de PRC para la detección).

Elución proteica

La elución de proteínas es impulsada por la repulsión de carga electrostática, ya que el pH se reduce a valores por debajo del pI de la proteína y por debajo del pKa del ligando. La elución se desencadena al reducir el pH (de 7 a 2) porque algunas proteínas pueden eluirse sin ningún cambio en el pH simplemente disminuyendo la concentración de sal. A escala de laboratorio, la optimización se puede lograr mediante experimentos de elución de gradiente de sal descendente; mientras que la elución gradual se seleccionará a escala de proceso. Este enfoque también puede servir para resolver la proteína objetivo a partir de impurezas cuyas características hidrofóbicas difieren. Las proteínas básicas se desorberán antes en el gradiente de pH o en la secuencia de elución por pasos, seguidas de más proteínas ácidas.

A diferencia de la HIC tradicional, la proteína objetivo se recupera en tampón diluido, lo que reduce la necesidad de diafiltración intermedia, ahorra operaciones de la unidad y contribuye a una mejor economía del proceso.